The presented thesis concentrates on the metabolism of three AAS in the human body and the synthesis of potential new long-term metabolites. It demonstrates an effective way of introducing new markers to anti-doping analysis and finally confirming the proposed structures. First, the substrate specificity of a human CYP (21A2) was elucidated to use its stereoselective hydroxylation capacity for the targeted synthesis of new metabolites of several AAS. Second, new metabolites of MD and MT were synthesized chemically, characterized, and detected in urine samples. Third, a controlled administration study with DHCMT was performed to reveal the metabolism of this doping substance and provide kinetic data of the metabolic products. Different synthesis methods were used depending on the structure: either a full chemical or a combined chemical and biotechnological approach. Several analysis techniques were used to provide sufficient information during the particular project steps. To verify intermediate products in the synthesis, gas chromatography coupled by electron ionization to single quadrupole-mass spectrometry (GC-EI-MS) was used. NMR experiments together with GC-EI-MS and gas chromatography coupled by electron ionization to quadrupole time-of-flight-mass spectrometry (GC-EI-QTOF-MS) were used for the structure elucidation of the synthesized reference material. Post administration samples were analyzed by GC-EI- QQQ-MS and LC-ESI-QTOF-MS. The results of this thesis show the ideal way of providing reference material to the anti-doping community or every other research field that is dealing with the metabolism of endogenous and exogenous substances in case that the concentrations are too low for other means of comprehensive identification. In a first step, the synthesis of reference material must be planned, and the used compounds, e.g., enzymes or reagents, must be evaluated for their potential use. Subsequently, the synthesis has to be performed, and the product needs to be fully characterized so that there is no doubt of its structure. Finally, an administration of the parent compound and subsequent analysis of the excreted metabolites confirm the previous work. In summary, this work shows how new ideas about metabolism should be dealt with. It helps to dispel the doubts that have existed for years about postulated results. At the same time, it shows that steroid metabolism still has various blind spots, whose elucidation must be the goal of further research. Although anti-doping was the all-dominant topic, the gained results are also relevant for fields in physiology and pharmacology.
Die vorliegende Arbeit konzentriert sich auf den Metabolismus von drei AAS im menschlichen Körper und die Synthese von potentiellen neuen Langzeitmetaboliten. Es wird ein effektiver Weg aufgezeigt, um neue Marker in die Anti-Doping-Analyse einzuführen und schließlich die vorgeschlagenen Strukturen zu bestätigen. Zuerst wurde die Substratspezifität eines menschlichen CYP (21A2) aufgeklärt, um dessen stereoselektive Hydroxylierungskapazität für die gezielte Synthese neuer Metaboliten mehrerer AAS zu nutzen. Folgend wurden neue Metaboliten von MD und MT chemisch synthetisiert, mittels Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) charakterisiert und in Urinproben nachgewiesen. Um den Metabolismus dieser Dopingsubstanz aufzudecken und kinetische Daten der Metabolite zu erhalten, erfolgte letztlich eine kontrollierte Ausscheidungsstudie mit DHCMT. Je nach Struktur wurden unterschiedliche Synthesemethoden verwendet: entweder ein vollchemischer oder ein kombinierter chemisch-biotechnologischer Ansatz. Um in den einzelnen Projektschritten ausreichend Informationen zu erhalten, wurden verschiedene Analysetechniken eingesetzt. Um die Zwischenprodukte in der Synthese zu verifizieren, wurde Gaschromatographie gekoppelt mit Elektronenionisations-Single- Quadrupol-Massenspektrometrie (GC-EI-MS) verwendet. Für die Strukturaufklärung des synthetisierten Referenzmaterials wurden NMR-Experimente zusammen mit GC-MS und Gaschromatographie gekoppelt an Elektronenionisations-Quadrupol-Flugzeit- Massenspektrometrie (GC-EI-QTOF-MS) verwendet. Die Proben der Ausscheidungsstudie wurden mittels GC-EI-QQQ-MS und LC-ESI-QTOF-MS analysiert. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen den idealen Weg, der Anti-Doping-Gemeinschaft oder anderen Forschungsbereichen, die sich mit dem Metabolismus von endogenen und exogenen Substanzen beschäftigen, Referenzmaterial zur Verfügung zu stellen, falls die Konzentrationen zu gering sind, um sie mit anderen Mitteln umfassend charakterisieren zu können. In einem ersten Schritt muss die Synthese von Referenzmaterial geplant und die verwendeten Verbindungen, z.B. Enzyme oder Reagenzien, auf ihre mögliche Verwendung hin evaluiert werden. Anschließend muss die Synthese durchgeführt und das Produkt vollständig charakterisiert werden, so dass kein Zweifel an seiner Struktur besteht. Schließlich bestätigen eine Verabreichung der Ausgangsverbindung und die anschließende Analyse der ausgeschiedenen Metaboliten die bisherige Arbeit. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, wie mit neuen Ideen zum Metabolismus umgegangen werden sollte. Sie hilft, die seit Jahren bestehenden Zweifel an postulierten Ergebnissen auszuräumen. Gleichzeitig zeigt sie, dass der Steroidstoffwechsel noch verschiedene blinde Flecken hat, deren Aufklärung das Ziel weiterer Forschung sein muss. Obwohl Anti-Doping das alles beherrschende Thema war, sind die gewonnenen Ergebnisse auch für Bereiche der Physiologie und Pharmakologie relevant.
