This work focused on the development of mucin-inspired virus binding inhibitors and their influence on the multivalent binding process of influenza A viruses (IAVs). New approaches of influenza virus inhibition are required, due to continuous mutations of influenza viruses by antigenic drift and shift, which lead to a decreased efficiency or resistance of currently used monovalent antiviral drugs. To this end, hyperbranched polyglycerols (hPG) were functionalized with typical terminal functional groups occurring in mucins: sialic acid and sulfate moieties. As recent theoretical investigations indicated a strong impact of inhibitor size on inhibitor efficiency,[163] the polymeric scaffold was systematically varied in size bridging 2 to 3 order of magnitudes in molecular weight (10 kDa to 2600 kDa). The inhibition efficiency was tested with HAI assay and cell binding experiments. Neither these methods nor other established methods like glycan micro array, BLI and AFM are able to detect the induced change of the multivalent virus-receptor binding interaction by the addition of inhibitor. Hence, the establishment of a new approach was necessary to monitor inhibitor-induced changes of multivalent virus-receptor interaction. This goal was accomplished in the first project, in which a TIRF-based assay for investigation of multivalent IAV binding events was developed. Here, the binding of single IAVs to sialic acid containing GD1a receptors within a fluid phase-supported lipid bilayer (SLB, serving as artificial membrane) out of phosphatidylcholine (POPC) lipids was investigated. As expected, an increasing content of GD1a receptors within the SLB led to higher number of binding viruses (= higher attachment rate) and at a certain GD1a concentration the attachment rate saturated. The analysis of the virus mobility (2D diffusion) of bound IAVs was used to deconvolute the residence time distribution from valency effects. It was hypothesized that bound IAVs with high average binding valency show slow and IAVs with low average binding valency fast diffusion coefficients. By sorting the IAVs binding events in similar diffusion coefficient ranges (= same average binding valency) the detachment rate distributions for each average binding valency were derived. The detachment rate distribution showed the expected decrease in detachment rate with increasing valency but also exposed an unexpected peak with elevated detachment rates at a certain average valency. The detachment rate peak decreased in a dose-dependent manner with the addition of zanamivir, a monovalent neuraminidase (NA) inhibitor. This indicated that the interplay of hemagglutinin (HA) and NA was responsible for the peak and due to the NA inhibitor, the balance was shifted to HA interactions. Additionally, the attachment rate increased in the presence of NA inhibitor. This powerful method was used to characterize the influence of mucin-inspired-binding inhibitors to IAV-binding processes in project 3. In the second project, an automated solvent-free method was established to synthesize hyperbranched polymers, which served as a multivalent scaffold for the synthesis of mucin-inspired virus inhibitors. The polymerization was performed with slow monomer addition and controlled by online-monitoring of the torque value of the anchor stirrer. This investigation showed that the torque value can be used as indirect indicator for the molecular weight of the hPG in the reactor. Since the molecular weight of the polymer increases with the amount of monomer, the viscosity increases as well as the mass in the reactor. Due to these two factors, an increasing force to stir (torque) is necessary to keep the stir frequency constant. The relation between measured torque and the corresponding molecular weight was determined empirically in terms of a calibration curve. Knowing this relation, an automated, reproducible method was established to synthesize hPGs with defined molecular weights. The third project focused on the synthesis and characterization of mucin-inspired virus binding inhibitors with different sizes (ranging between 10 to 2600 kDa). Small hPG (10 kDa) was provided by the solvent-free polymerization method out of project 2. Higher molecular weights of hPG were synthesized using a recently developed two-step synthesis approach. Each hPG was functionalized with sialic acid (5 mol%) and sulfate (5 mol%) in a multivalent fashion. The highest molecular weight meets the size of natural mucins (MDa range) and resulted after the functionalization in a mucin-inspired virus-binding inhibitor. The investigated binding inhibition in the HAI assay and IC50 value of the TIRF assay-derived attachment rate showed enhanced inhibition with increasing inhibitor size. The most effective was the mucin-inspired virus binding inhibitor based on the 2600 kDa hPG scaffold. Interestingly, the TIRF measurements revealed a biphasic binding behavior. An unexpected attachment rate increase at low inhibitor concentrations and an expected decrease at high inhibitor concentrations were observed. This phenomenon was verified by binding of IAVs to MDCK-II cells. The biphasic binding behavior indicated that the inhibitor binds preferably to NA of the IAV at low inhibitor concentrations, resulting in increased virus attachment to the receptors in the SLB (higher attachment-rate). At higher inhibitor concentrations, the inhibitor also binds to HA and causes a decrease in attachment of IAV (lower attachment rate). The effect can be explained with higher affinities of NA to sialic acids compared the affinity of HA to sialic acids and supports the idea that NA also contributes to the attachment process.
Diese Arbeit beschreibt die Entwicklung von Mucin-inspirierten Virenbindungsinhibitoren und deren Einfluss auf den multivalenten Bindungsprozess von Influenza A Viren (IAVs). Neue Herangehensweisen für die Inhibition von Influenza Viren sind nötig, da die kontinuierliche Mutation von Influenza Viren durch Antigendrift und -shift häufig zu einer niedrigeren Effizienz oder sogar Resistenz von den zurzeit benutzten monovalenten antiviralen Wirkstoffen führt. Zu diesem Zweck wurden hochverzweigte Polyglycerole mit typischen in Mucinen vorkommenden terminalen funktionellen Gruppen, Sialinsäuren und Sulfatgruppen, funktionalisiert. Da kürzlich theoretische Untersuchungen einen starken Einfluss der Inhibitorengröße aufgezeigt haben, wurde das Polymergerüst systematisch in der Größe so variiert, dass das Molekulargewicht 2 bis 3 Größenordnungen umfasst (10 kDa bis 2600 kDa). Die Inhibitoreneffektivität wurde mit dem Hämagglutination Inhibition (HAI) Test und Zellbindungsexperimenten untersucht. Diese Methoden und auch andere etablierte Methoden wie Glykan-Mikroarray, Bio-Schicht-Interferometrie (BLI) oder Rasterkraftmikroskopie ermöglichen nicht, die Veränderung der multivalenten Virus-Rezeptor-Wechselwirkung durch Zugabe der Inhibitoren zu messen. Im ersten Projekt wurde ein Assay basierend auf Interne Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRF) für die Untersuchung von multivalenten IAV Bindungsvorgängen entwickelt. Hierbei wurden Bindungsvorgänge von einzelnen Viren an GD1a Rezeptoren mit Sialinsäuren innerhalb einer festkörperunterstützten Lipiddoppelschicht aus Phosphatidylcholin (POPC; in Flüssigphase) untersucht. Wie erwartet führte eine höhere GD1a Rezeptorkonzentration in der Lipiddoppelschicht zu einer größeren Anzahl an bindenden Viren (höhere Anbindungsrate) und ab einer bestimmten GD1a Konzentration war die Anbindungsrate abgesättigt. Die Analyse der Virusmobilität (2D Diffusion) von gebundenen Viren wurde verwendet, um die Verteilung der Verweildauer von den Valenzeffekten zu bereinigen. Die Hypothese war, dass gebundene Viren mit einer höheren Bindungsvalenz langsamere und IAVs mit niedrigeren Bindungsvalenzen schnellere Diffusionskoeffizienten aufweisen. Mit der Sortierung der IAV Bindungsvorgänge in ähnliche Diffusionskoeffizientenbereiche (= gleiche mittlere Bindungsvalenz) konnte die Ablöseratenverteilung für jede mittlere Bindungsvalenz abgeleitet werden. Die Ablöseratenverteilung zeigte eine erwartete Verminderung der Ablöserate mit steigender Valenz, aber deckte auch einen unerwarteten Peak mit erhöhter Ablöserate bei einer bestimmten Valenz auf. Der Ablöseratenpeak konnte mit der Zugabe von Zanamivir, einen monovalenten Neuraminidase-Inhibitor, dosisabhängig verringert werden. Das zeigt an, dass das Zusammenspiel von Hämagglutinin (HA) und Neuraminidase (NA) verantwortlich für den Peak ist und durch den NA-Inhibitor das Gleichgewicht zu HA Wechselwirkungen verschoben wurde. Zusätzlich erhöhte sich die Anbindungsrate in Anwesenheit von NA-Inhibitoren. Diese leistungsfähige Methode wurde benutzt, um den Einfluss von Mucin-inspirierten Bindungsinhibitoren auf den Bindungsvorgang von IAVs in Projekt 3 zu charakterisieren. Im zweiten Projekt wurde eine automatisierte lösemittelfreie Methode erarbeitet, um hyperverzweigtes Polyglycerol zu synthetisieren, welches als Gerüst für die Synthese von Mucin-inspirierten Virenbindungsinhibitoren dient. Die Polymerisation wurde mit einer langsamen Monomerzugabe durchgeführt und über Online-Überwachung des Drehmomentes des Ankerrührers gesteuert. Das Drehmoment kann als indirekter Indikator für das Molekulargewicht für das im Reaktor befindlichen hPG benutzt werden. Da sich das Molekulargewicht mit steigender Zugabe von Monomer erhöht, nimmt die Viskosität und die Masse in dem Reaktor zu. Wegen diesen zwei Faktoren ist eine erhöhte Rührkraft (Drehmoment) nötig, um die Drehfrequenz des Rührers konstant zu halten. Das Verhältnis der gemessenen Drehmomentwerte und der dazugehörigen Molekulargewichte wurden empirisch ermittelt. Mit dem Wissen des Verhältnisses konnte eine automatisierte, reproduzierbare Methode zur Synthese von hPG mit definiertem Molekulargewicht erstellt werden, das Grundlage für das dritte Projekt ist. Das dritte Projekt fokussierte sich auf die Synthese und Charakterisierung von Mucin-inspirierten Virusbindungsinhibitoren mit unterschiedlichen Größen (im Bereich von 10 kDa bis 2600 kDa). Kleines hPG (10 kDa) wurde von der lösemittelfreien Polymerisierungsmethode aus Projekt zwei bereitgestellt.[167] Höhere Molekulargewichte wurden mit einer kürzlich von Kizhakkedathu et al. entwickelten Zweistufensynthese hergestellt. Jedes hPG wurde mit Sialinsäure (5 mol%) and Sulfatgruppen (5 mol%) in multivalenter Weise funktionalisiert. Das höchste Molekulargewicht erreicht die Größe von natürlichen Mucinen (MDa Bereich) und ergab nach der Funktionalisierung ein Mucin-inspirierten Virenbindungsinhibitor. Die untersuchten Bindungsinhibitoren im HAI Assay und die ermittelten IC50 Werte des TIRF Assays zeigten eine gesteigerte Inhibition mit zunehmender Inhibitorengröße. Am effektivsten war der Mucin-inspirierte Virenbindungsinhibitor basierend auf dem 2600 kDa hPG Gerüst. Interessanterweise deckten die TIRF-Messungen ein biphasisches Bindungsverhalten auf, bei dem ein unerwarteter Anstieg der Anbindungsrate bei geringen Inhibitorkonzentrationen und die erwartete Abnahme bei höheren Inhibitorkonzentrationen beobachtet wurde. Dieses Phänomen wurde mit Bindungsexperimenten von IAV an MDCK-II Zellen verifiziert. Das biphasische Verhalten legt nahe, dass der Inhibitor bevorzugt an NA der IAVs bei geringen Inhibitorkonzentrationen bindet und resultiert in einer erhöhten viralen Anbindungsrate an den Rezeptoren in der Lipiddoppelschicht. Bei höheren Konzentrationen bindet der Inhibitor auch an HA und verursacht eine Abnahme der viralen Anbindungsrate. Der Effekt kann durch eine höhere Affinität von NA zu Sialinsäure verglichen mit HA zu Sialinsäure erklärt werden. Diese Beobachtung unterstützt die Hypothese, dass NA auch bei dem Bindungsprozess an die Zellmembrane mitwirkt.
