Kardiovaskuläre Erkrankungen sind die führende Todesursache weltweit. Insbesondere Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz und Diabetes mellitus sind von einer vorzeitigen ausgeprägten Kalzifizierung von Arterien betroffen. Bei der Mediasklerose nehmen glatte Gefäßmuskelzellen (VSMC) durch Transdifferenzierung einen osteochondrozytären Phänotyp mit Produktion kalzifizierender extrazellulärer Matrix an. Mesenchymale Stromazellen (MSC), die u.a. im Gefäßbett als Vorläuferzellen für VSMC an Regenerationsprozessen beteiligt sind, sezernieren zahlreiche Faktoren mit parakriner Wirkung, deren therapeutisches Potenzial aktuell Gegenstand zahlreicher Studien ist. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob MSC durch parakrine Effekte die osteoblastäre Transdifferenzierung und Kalzifizierung von VSMC in einem in vitro-Modell für die Mediasklerose beeinflussen können. Hierzu wurde die Wirkung von MSC-konditioniertem Medium (MSC-KM) auf die Aktivität der alkalischen Phosphatase (ALP) als frühem Marker der osteoblastären Differenzierung nach 7 Tagen und auf die Calciumablagerung nach 14 Tagen in VSMC untersucht, die zur osteoblastären Transdifferenzierung angeregt wurden. Im nächsten Schritt wurden Substanzen, die in das für die Differenzierung von MSC wichtige mTOR- Netzwerk eingreifen, auf ihre das MSC-Sekretom modifizierende Wirkung im Sinne einer pharmakologischen Präkonditionierung hin untersucht. Neben dem klassischen mTOR-Inhibitor Rapamycin wurden Metformin und Insulin mit inhibierender bzw. aktivierender Wirkung auf den mTOR-Signalweg verwendet. Außer Lösungsmittelkontrollen wurde von separat kultivierten VSMC konditioniertes Medium (VSMC-KM) als Kontrolle verwendet. Mittels Western-Blot-Analyse wurden die mTOR-Aktivität in den das Medium konditionierenden Zellen und Marker für Zellschicksalsprogramme in den kalzifizierenden VSMC untersucht. Die Behandlung von VSMC mit MSC-KM während der osteoblastären Transdifferenzierung reduzierte gegenüber VSMC-KM die ALP-Aktivität signifikant um ca. 25 % und die Calciumablagerungen signifikant um ca. 30 %. Durch Präkonditionierung der Spenderzellen mit Metformin und Rapamycin, nicht jedoch mit Insulin, konnte dieser Effekt signifikant gesteigert werden. Mittels Western-Blotting wurde eine stärkere basale Aktivität von AMPK und mehr an Position Serin-473 phosphoryliertes AKT in MSC verglichen mit VSMC nachgewiesen. Durch die Behandlung mit Rapamycin wurde die AMPK-Aktivität signifikant, mit Metformin in MSC zumindest tendenziell gesteigert. Die Behandlung mit Metformin und Rapamycin verminderte tendenziell die Menge von cleaved caspase 3 als Marker der Apoptose in kalzifizierenden VSMC. Auf gleiche Weise verminderte Rapamycin die Expression von p16 als Marker für zelluläre Seneszenz. Mit dieser Arbeit wurde gezeigt, dass MSC-KM glatte Gefäßmuskelzellen vor Kalzifizierung schützt. Die Präkonditionierung der MSC mit Rapamycin steigerte diesen protektiven Effekt ebenso wie die Behandlung mit Metformin. Hierbei schien Rapamycin das MSC-Sekretom positiv zu beeinflussen, während Metformin eher direkt in den Kalzifizierungsprozess eingriff. Die Verstärkung der protektiven Effekte des MSC-Sekretoms wurde vermutlich durch eine Aktivierung der AMPK hervorgerufen.
Cardiovascular disease is the leading cause of mortality worldwide. Especially patients with diabetes mellitus and chronic kidney disease suffer from early vascular calcification. In the development of arteriosclerosis vascular smooth muscle cells (VSMC) transdifferentiate into osteochondrogenic cells and produce extracellular calcifying matrix, hence accelerating the calcification process. Mesenchymal stromal cells (MSC), among others serving as VSMC pregenitor cells in the vascular bed, are well known for their paracrine effects which are currently being studied. This study was designed to investigate MSC secretome’s effect on VSMC transdifferentiation and calcification in an in vitro model for arteriosclerosis. Therefore VSMC calcification was measured by alcaline phosphatase (ALP) activity – a marker for early osteoblast differentiation – after 7 days and calcium deposition after 14 days under treatment with MSC conditioned medium (MSC-CM). Further, MSC were preconditioned with drugs interacting with the mTOR pathway, a crucial signalling network for MSC differentiation. Rapamycin, a classic mTOR inhibitor, and antidiabetic drugs metformin and insulin were used, inhibiting or activating mTOR signaling, respectively. Controls were provided using conditioned media from separately cultured VSMC (VSMC-CM) with or without solvent as appropriate. Western blot analysis was performed to estimate mTOR signaling activity in media conditioning cells and cell fate markers were measured in calcifying VSMC. MSC-CM reduced ALP activity by 25 % and calcium deposition by 30 % approximately in calcifying VSMC compared to VSMC-CM. Preconditioning with metformin and rapamycin, but not with insulin, further attenuated VSMC calcification significantly. Signaling analysis showed stronger basal activity of AMPK in MSC than in VSMC and stronger 473-phosphorylation of AKT. Treatment with rapamycin significantly enhanced AMPK phosphorylation in MSC, treatment with metformin induced a trend to increased AMPK activation. Apoptosis seemed to be reduced by treatment with metformin and rapamycin, respectively, as seen in a reduction of cleaved caspase 3. Cellular senescence seemed to be alleviated by treatment with rapamycin as seen in a reduction of p16. This study showed that MSC-CM attenuates VSMC calcification. Preconditioning MSC with metformin or rapamycin enhanced beneficial effects. Whereas metformin seemed to directly protect VSMC from calcification, rapamycin modulated MSC-CM’s beneficial effects. MSC secretome seemed to be influenced by AMPK activation.
