In spite of recent advancements in structure elucidation of Photosystem II (PSII), by far not the complete catalytic cycle of photosynthetic water oxidation is sufficiently well understood. Open questions concern the type of O-O bond formation mechanism, the nature of the substrate water molecules, the role of protein-internal H-bond networks and the sites of proton release and exit. Time-resolved infrared (IR) spectroscopy provides information about protonation states, H-bonding networks and bond strengths. On oxygen-evolving PSII, there have been less than five reports of time-resolved IR spectroscopy, but either they presented only a few wavenumbers of pure spectral resolution (16 cm-1) or were not free of distortion by a laser-induced heat artefact. In this thesis, a new alternative experiment is described that employs a continuous-wave Quantum-Cascade-Laser for single-frequency IR (SFIR) detection of absorption transients induced by a series of nanosecond laser flashes (532 nm). It became possible to detect IR absorption smaller than 10^-5 OD in the time domain from 40 ns to s at wavenumbers ranging from 1300 to 1650 cm-1. The setup comprises automatic sample exchange, data recording, a temperature control system and an adapted measurement protocol. The latter includes a flash sequence that drives the PSII synchronously through its reaction cycle (the S-state cycle PSII) and allows to correct for the flash-induced heat artefact, reproducibly. Reliable data now can be recorded at ten wavenumbers per day. (1) First, FTIR steady-state measurements, variable chlorophyll fluorescence and the SFIR experiment were combined to track the electron transfer from the first (QA) to the second (QB) quinone electron-acceptor of PSII. The decay kinetics of QA were found to be identical in the SFIR transients at 1478 cm-1 and the variable fluorescence yield. This finding and the analysis of the "connectivity" resulting from inter-PSII excitation energy transfer revealed that connectivity-corrected fluorescence traces the QA-QB electron transfer very well, thereby verifying assumptions and models used thousands of times in physiological studies. (2) I contributed to an ongoing discussion about the position of the CO stretching vibration of the redox active tyrosine radical YZox . Using the high spectral resolution, a clear signal assignable to YZox could be identified at 1512.5-1515 cm-1. The band formed faster than 40 ns and decayed with the known Mn oxidation kinetics. Its position is the same as in Mn depleted samples, surprisingly suggesting similar H-bond properties. (3) I could show that the symmetric stretching region of carboxylates senses almost all kinetic components of the previously proposed extended reaction cycle of PSII water oxidation, which is characterized by alternating removal of electrons and protons from the catalytic site of water oxidation. Moreover, three so far unidentified bands showing either a 300 ns or a 30 µs phase are found in the S2->S3 and S3->S0 transitions. (4) With Richard Debus (UC Riverside), we established a protocol to investigate PSII core complexes extracted from Synechocystis with time-resolved SFIR. First, it was verified that the kinetics of the reaction cycle of the cyanobacterial PSII are identical to that of spinach PSII. Then I obtained the very first time-resolved IR transients on genetically modified PSII. Introducing an alanine instead of an aspartate at the crucial 61 position of the D1 protein did not slow down the fast proton release phase in S2->S3 and S3->S0, but the Mn oxidation - especially in S3->S0. This excludes a direct involvement of the D61 residue in the early proton release but creates new questions on the mechanism of water oxidation. In summary, the development of a new (superior) experimental approach for time-resolved tracking of the events in the PSII reaction cycle has facilitated new insights and opens up a variety of new avenues in PSII research.
Dank der vor Kurzem erschienenen strahlungsschädenfreien, hochaufgelösten Kristallstrukturen gab es rasante Fortschritte im Verständnis der photosynthetischen Wasserspaltung im Photosystem II. Dennoch verbleiben noch offene Fragestellungen, vor allem bezüglich des eigentlichen O-O Bindungsmechanismuses, der Identifikation der Substratwassermoleküle, sowie der jeweiligen Protonenfreisetzungsschritte und -pfade. Mit zeitaufgelöster Infrarotspektroskopie können Bindungsänderungen von beteiligten Aminosäuren und Kofaktoren detektiert werden, die wiederum empfindlich gegenüber den Protonierungszustand und Stärke der Wasserstoffbrückenbindungen sind. Bisher sind jedoch weniger als fünf mit einer ungenügenden Auflösung von 16 cm-1 gemessen Publikationen an Sauerstoff entwickelndem Photosystem II veröffentlicht worden. Das messzeitintensive Step Scan Experiment unsrer Gruppe ist dagegen nicht frei von einem Anregungslaser induziertem Hitzeartefakt. In der hier präsentierten Arbeit stelle ich einen von mir entwickelten, dauerstrich Quantenkaskadenlaser basierten Einzelfrequenz-IR-Aufbau (EFIR) vor, der es erlaubt, Transienten mit einer zeitlichen Auflösung von 40 ns und Absorptionsänderungen von weniger als 10-5 OD im Bereich von 1300 bis 1650 cm-1 zu messen. Der Probenaustausch und die Datenaufnahme funktionieren voll automatisch. Dazu habe ich ein Messprotokoll entwickelt, das es ermöglicht den vom Anregungslaser induzierten Hitzeartefakt reproduzierbar zu korrigieren. (1) Im ersten Projekt wurden FTIR Differenzspektroskopie mit der variablen Chlorophyll a Fluoreszenz und dem neuen EFIR kombiniert, um den Elektronentransfer zwischen den beiden Chinonen zu vermessen. Es stellte sich heraus, dass die Kinetiken im EFIR und in der Fluoreszenz identisch sind. Zusammen mit der Analyse der Anregungsenergieaustausch basierten Fluoreszenskorrektur, konnte ich erstmals direkt die angewandte Korrekturmethode verifizieren, die als eine der Standardmethoden in der Pflanzenphysiologie genutzt wird. (2) Als Weiteres wurde die CO Streckschwingung des YZ Radikals zwischen 1512,5 und 1515 cm-1 im S2->S3 and S3->S0 gefunden. Die Bande wird innerhalb von 40 ns gebildet und zerfällt mit den charakteristischen Zeiten der Mangan Oxidation. Hiermit konnte ich zu einer anhaltenden Diskussion mehrerer Gruppen beitragen und diese (eventuell) lösen. (3) Es wurde eine Region der symmetrischen Carboxylatstreckschwingungen von 25 cm-1 identifiziert, in der alle bisher bekannten Schritte des erweiterten Reaktionszykluses des Mn4Ca-µ-oxo-Clusters beobachtet werden können. Drei bisher nicht zugeordnete Banden wurden gefunden, die entweder mit 300 ns oder 30 µs zerfallen. Diese könnten zu vorübergehend deprotonierten Carboxylaten gehören. Zusammen mit Richard Debus von der UC Riverside konnte ich feststellen, dass PSII Kernkomplexe von Synechocystis sp. PCC 6803 nur leicht veränderte Kinetiken und Spektren des Photozykluses aufweisen. (4) Als letztes konnten die ersten zeitaufgelösten Infrarotmessungen an genetisch verändertem PSII aufgenommen werden. Das durch Alanin ersetzte Carboxylat (D1-D61) bindet über eine Wasserstoffbrücke zu einem Mn ligierendem Wasser und befindet sich am Beginn eines vorgeschlagenem Protonenkanals. Die Kinetik zeigte keine Verzögerungen der Protonenfreisetzungsdynamiken, was einen Einschluss der Umgebung und des Kanals zu diesen Zeiten ausschließt. Die Mn Oxidierung dagegen zeigte komplexes und verlangsamtes Zeitverhalten und eine Änderung der Amplituden. Dies verwirft einige vorgeschlagenen Hypothesen, erzeugt aber umso mehr neue Fragen über den Mechanismus der Wasseroxidation. Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass ein neuer, vielversprechender experimenteller Ansatz zur zeitaufgelösten Messung der einzelnen Reaktionschritte des Photosystems II entwickelt wurde, der bereits neue Erkenntnisse lieferte und eine Reihe an Möglichkeiten zukünftiger Forschung eröffnet.
