Glycosylation is an important post-translational modification of both soluble and membrane-bound proteins. N-Glycans have a significant role in in protein folding, protein stability and functions, as well as cell recognition, cell-cell interactions, cell-cell communication and adhesion. Changes in glycosylation were observed in many pathological processes, for example inflammation and malignancies, which had led to studies of N-glycans as potential diagnostic or prognostic biomarkers. While several biomarkers have been suggested, there has been a lack of studies on how preanalytical conditions influence the results of glycomic studies. One aim of this thesis was to investigate how preanalytical variables such as time of coagulation can influence the results and bring to inaccurate conclusions. I expected that the activity of exoglycosidases such as sialidases and mannosidases depend on the time and temperature at which the samples are stored before being processed. In addition, it was investigated how the composition of the serum/plasma glycome is modified when glycoproteins from intracellular cell organelles are released from leukocytes that are undergoing lysis. Another potential source of errors could be the shedding of cell surface glycoproteins from erythrocytes. Glycoproteins from serum/plasma released by PNGase F digestion and part of the N-glycan pool was permethylated and analyzed by MALDI-TOF-MS and the rest of the pool was chemically desialylated, derivatized with APTS and measured by CE-LIF. Statistical analysis was performed with SPSS. The results of experiments were published as recommendations for the preanalytical conditions for glycome analysis in human serum and plasma. This study provided useful information to the future use of glycan-based biomarkers in health and disease and for the second part of this study. The investigation showed that samples, which are hemolysed, might provide inaccurate results, thus only non-hemolysed samples were used for the second part of this thesis. Sialylation is of fundamental importance for understanding the causes and pathological alterations of the serum glycome. In human blood and tissues, sialic acids are either α-2,3- or α-2,6-linked to galactoses. As they are the most exposed monosaccharides to the outer environment, they play a key role in many biological processes including cancerogenesis. To date, although increases of sialic acids in the serum glycome have been 9 correlated with ovarian cancer, the type of sialic acid linkage on serum glycoproteins has not been investigated. The group of Prof. Dr. rer. nat. Blanchard recently identified characteristic changes of the serum glycome that were combined in a score named GLYCOV that could diagnose primary epithelial ovarian cancer in a better way than CA125 the routine serum marker even for early stage patients. GLYCOV contains seven sialylated N-glycans but the type of sialic acid linkage has not been investigated yet. The second aim of this thesis was to obtain information about sialylation patterns from a cohort of more than 100 ovarian cancer patients regarding sialic acid linkages. Firstly, a suitable derivatisation had to be selected from a wide range of previously published methods. Multiple methods were tested and evaluated for their use with ovarian cancer samples. Secondly, the selected method was applied to investigate the type of sialylation in the serum of epithelial ovarian cancer. A cohort of more than 100 patients including FIGO stages I, II, III and IV as well as age-matched controls was enrolled in this study. Glycoproteins from serum were released by PNGase F digestion and the N-glycan pool was derivatized using 1-hydroxybenzotriazole and 1-ethyl-3-(3-(dimethylamino)propyl)-carbodiimide as activators for amidation. α-2,6-Linked sialic acids were amidated with dimethylamine forming pH stable products, while the α-2,3-linked sialic acids were lactonized with the neighboring galactose and subsequently amidated with ammonia and measured by MALDI-TOF-MS. Statistical analysis was performed with SPSS and MedCalc to evaluate if the information regarding sialylation linkage enables improvement in ovarian cancer diagnostic. The observed differences in α-2,3/α-2,6-sialylation ratio in combination with routinely used ovarian cancer biomarker CA125 enabled improved ovarian cancer diagnostic with sensitivity and specificity of 89.6% and 100%, respectively. CA125 alone showed sensitivity of 84.4% and specificity of 97%.
Die Glykosylierung ist eine wichtige posttranslationale Modifikation von löslichen- und membrangebundenen Proteinen. N-Glykane nehmen eine bedeutende Rolle in der Proteinfaltung, Proteinstabilität und -funktionen ein und haben entscheidenden Einfluss auf Prozesse wie Zellerkennung, Zell-Zell-Wechselwirkungen, Zell-Zell-Kommunikation und Adhesion. Änderungen in der Glykosylierung wurde in vielen pathologischen Prozessen, wie Entzündungen und Malignomen beobachtet, was zu Studien der N-Glykananalyse als potentiell diagnostische oder prognostische Biomarker geführt hat. Obwohl in diesem Zusammenhang mehrere Biomarker vorgeschlagen wurden, wurde der Einfluss prä-analytischer Bedingungen bezüglich der Ergebnisse unzureichend betrachtet. Ein Ziel dieser Arbeit war zu untersuchen, wie prä-analytische Variablen, beispielsweise die Gerinnungszeit, Ergebnisse beeinflussen können und zu falschen Schlussfolgerungen führen. Wir erwarteten, dass die Aktivität von Exoglykosidasen, wie Sialidasen und Mannosidasen, von der Lagerungszeit und Lagerungstemperatur bis zur Bearbeitung der Proben abhängig ist. Weiterhin wurde untersucht, ob sich die Komposition des Serum- und Plasmaglykoms, nach lytischer Freisetzung der Glykoproteine aus leukozytischen intrazellulären Organellen, ändert. Eine weitere potentielle Fehlerquelle können von der Erythrozytenoberfläche abgelöste Glykoproteine sein. Die N-Glykane von Serum- und Plasma-Glykoproteinen wurden enzymatisch mit PNGase F freigesetzt und volumenanteilig geteilt. Ein Teil wurde permethyliert und mit MALDI-TOF-MS analysiert, der andere Teil chemisch desialyliert, mit APTS derivatisiert und mittels CE-LIF gemessen. Die statistische Analyse wurde mit SPSS durchgeführt. Die Ergebnisse dieser Studie wurden als Empfehlung von prä-analytischen Bedingungen für die Glykomanalyse von humanem Serum und Plasma publiziert. Darüber hinaus werden nützliche Informationen für zukünftige Untersuchungen von glykanbasierten Biomarkern im gesunden Körper und bei Krankheiten bereitgestellt. Unsere Untersuchungen zeigten, dass hämolysierte Proben zu falschen Ergebnissen führen, sodass für den zweiten Teil dieser Arbeit ausschließlich nicht-hämolysierte Proben verwendet wurden. Die Sialylierung ist von fundamentaler Bedeutung für das Verständnis der Ursachen und den pathologischen Änderungen des Serumglykoms. In humanem Blut und 6 Geweben sind Sialinsäuren entweder α-2,3 oder α-2,6 mit den Galaktosen verknüpft. Da sie die am meisten exponierten Monosaccharide gegenüber der Umgebung sind, spielen sie eine Schlüsselrolle in vielen biologischen Prozessen, einschließlich der Karzinogenese. Bisherige Untersuchungen zeigten, dass eine Zunahme der Sialinsäuren im Serum-N-Glykom mit dem Ovarialkarzinom korreliert, jedoch wurden die Bindungstypen der Sialinsäuren von Serum-Glykoproteinen nicht untersucht. Die Arbeitsgruppe von Prof. Blanchard identifizierte kürzlich charakteristische Änderungen im Serumglykom, welche zu einem Wert (GLYCOV) kombiniert wurden und eine bessere diagnostische Leistung, für das epitheliale Ovarialkarzinom gegenüber dem routinemäßigen Serummarker CA125, selbst für Patientinnen im Frühstadium, zeigte. Der GLYCOV beinhaltet sieben sialylierte N-Glykane, jedoch wurden deren Bindungstypen bezüglich der Sialinsäuren bis jetzt nicht untersucht. In diesem Zusammenhang sollten aus einem Patienteninnenkollektiv mit epithelialen Ovarialkarzinom weitere Informationen hinsichtlich der Sialylierungsmuster generiert werden. Zunächst musste aus einer Vielzahl bislang veröffentlichter Methoden, eine geeignete Derivatisierung ausgewählt werden. Dazu wurden mehrere Methoden für ihre Verwendung der Ovarialkarzinom-Proben getestet und ausgewertet. Im Anschluss wurde die ausgewählte Methode verwendet, um die Sialylierung im Serum von Ovarialkarzinom-Patientinnen zu untersuchen. Die Studie umfasste mehr als 100 Patientinnen mit allen FIGO Stadien (I, II, III und IV) sowie alterskorrelierten gesunden Kontrollen. Die N-Glykane von Serum-Glykoproteinen wurden mit PNGase F freigesetzt und mit 1-Hydroxybenzotriazol sowie 1-Ethyl-3-(3-(dimethylaminopropyl)carbodiimid als Aktivatoren der Amidierung derivatisiert. α-2,6-verknüpfte Sialinsäuren wurden mit Dimethylamin zu einen pH-stabilen Produkt amidiert, wohingegen α-2,3-verknüpfte Sialinsäuren mit der benachbarten Galaktose laktonisiert und anschließend mit Ammonium amidiert wurden. Die Analyse erfolgte mittels MALDI-TOF-MS und die statistische Auswertung wurde mit SPSS und MedCalc durchgeführt. Dabei sollten die Ergebnisse hinsichtlich der Verknüpfung von Sialinsäuren für eine verbesserte Diagnostik des Ovarialkarzinoms abgeschätzt und evaluiert werden. Die beobachteten Unterschiede des Sialylierungsverhältnisses von α-2,3/α-2,6-Sialylierung ermöglichte, in Kombination mit dem routinemäßig verwendeten Ovarialkarzinom Biomarker CA125, eine verbesserte 7 Diagnostik mit einer Sensitivität von 89.6 % und Spezifität von 100%. Unter alleiniger Verwendung von CA125 konnte eine Sensitivität von 84.4% und Spezifität von 97% erzielt warden.
