Most of the recently approved biopharmaceuticals represent drugs that are produced by biotechnological processes involving recombinant DNA. Protein-based biopharmaceuticals are emerging on the pharmaceutical market due to their high target selectivity in specific diseases. In parallel, a growing interest by other companies to produce similar or highly similar follow-on biopharmaceuticals exits, once the patent of blockbuster biotherapeutics is about to expire. In correlation to their complex structure, an analytical challenge is facing the approval of these biosimilars. Since the biological product’s critical quality attributes (CQAs) could be influenced by manufacturing process conditions, health authorities (e.g. FDA and EMA) have issued several guidelines to define CQA during manufacturing process changes. Investigation of possible batch-to-batch variations that may occur during the biotechnological production process of reference and follow-on biopharmaceutical is referred to as an internal comparison. Comparing two biopharmaceutical products from different manufacturers to demonstrate biosimilarity is extremely challenging. Here, we refer to this type of comparability as an ‘external’ comparison. Since biosimilars differ from generic small molecules, the demonstration of biosimilarity requires extensive analytical tools. In the current study, physicochemical characterization using state-of-the-art analytics was performed to analyze intact and subunit masses, post-translational modifications (PTMs), higher order structure (HOS) and potency of the reference biotherapeutics Mabthera® (Roche), Enbrel® (Pfizer) and NovoSeven® (Novo Nordisk), and their respective biosimilars Zytux™, AryoSeven™ and Altebrel™ (AryoGen Pharmed) in accordance to CQA of biopharmaceuticals. A special focus was given to N-glycosylation due to its potential to monitor the batch-to-batch consistency and alteration during the production bioprocess. Head-to-head comparability of three batches Mabthera® and Zytux™ comprising intact mass analysis, middle-up approach as well as subunit analysis revealed similar glycoforms but additional lysine (Lys) variants in the biosimilar. The N-glycosylation site was confirmed for both, the reference product and biosimilar. PTMs and HOS were confirmed to be comparable. However, comparison of the N-glycosylation profiles obtained from three batches of the biosimilar and the reference product showed quantitative variations, although the N-glycans were qualitatively similar. Furthermore, functional properties were compared to investigate the impact of glycosylation alteration and PTMs on potency within the biosimilar batches and between reference and follow-on biodrug. The data affirm that the analytically detected differences are still in the acceptable range for biosimilarity. Regarding Eptacog alfa biopharmaceuticals, physicochemical properties were analyzed based on mass spectrometry, including intact mass, PTMs and higher-order structure. N-glycopeptide analysis with UHPLC-QTOF-MSE confirmed all N-glycosylation sites as well as two different O-glycopeptide sites. Serine (Ser)60 was found to be O-fucosylated and Ser52 had O-glucose or O-glucose-(xylose)1,2 motifs as glycan variants. Both biotherapeutics (NovoSeven®, AryoSeven™) exhibit a batch-to-batch variability in their N-glycan profiles. Traveling wave ion-mobility spectrometry (TWIMS) and NMR (nuclear magnetic resonance) spectroscopy affirm close similarity of the higher-order structure of both biopharmaceuticals. Potency of the biodrugs was analyzed by a coagulation assay demonstrating comparable bioactivity. Physicochemical characterization using state-of-the-art analytics was performed to reference product Enbrel® and its biosimilar Altebrel™. Intact mass and subunit analysis revealed a size of about 126 kDa for both biopharmaceuticals. Similar glycoprotein species for the complete monomer and the fragment crystallizable (Fc) region domain of reference and follow-on product were observed, however, small differences in Lys variants and oxidation were found. N-Glycopeptide analysis with UHPLC-QTOF-MSE confirmed the N-glycosylation sites (Asn149, Asn171 and Asn317) as well as Fc-specific glycosylation on Asn317, and tumor necrosis factor receptor (TNFR)-specific highly sialylated glycans on Asn149 and Asn171 for both investigated products. Small quantitative variations in the N-glycan profile were detected, although the N-glycans were qualitatively similar. Four different O-glycopeptides bearing core 1-type glycans were detected. For both, N- and O-glycopeptide analysis, determination was achieved without prior cleavage of the sialic acid residues for the first time. In addition, ion-mobility spectrometry confirmed close similarity of higher-order structure of both biopharmaceuticals. Furthermore, a neutralization assay, investigating the impact of altered PTMs on potency, indicated that the differences within all batches are still in the acceptable range for biosimilarity.
Die meisten der kürzlich zugelassenen Biopharmazeutika repräsentieren Therapeutika, die durch biotechnologische Prozesse unter Verwendung rekombinanter DNA produziert werden. Proteinbasierende Biopharmazeutika sind wegen ihrer hohen Targetselektivität in spezifischen Erkrankungen immer häufiger auf dem pharmazeutischen Markt vertreten. Zudem existiert ein immer größer werdendes Interesse anderer Firmen ähnliche oder sehr ähnliche Nachfolger-Biologika zu produzieren, sobald das Patent der teuren Originator-Biotherapeutika dabei ist abzulaufen. Aufgrund ihrer komplexen Struktur steht der Zulassung der Biosimilare eine analytische Herausforderung gegenüber. Da die kritischen Qualitätsattribute eines biologischen Produktes durch die Schritte des Herstellungsprozesses beeinflusst werden können, haben die Gesundheitsorganisationen (z. B. FDA und EMA) verschiedene Richtlinien erlassen, um die kritischen Qualitätsattribute bei Veränderungen des Herstellungsprozesses zu definieren. Allerdings ist der Nachweis der Biosimilarität beim Vergleich zweier biologischer Produkte von verschiedenen Herstellern sehr herausfordernd. In der vorliegenden Arbeit wird diese Art des Vergleichs als “externer Vergleich” bezeichnet. Da Biosimilare sich von generischen Molekülen unterscheiden, setzt die Darstellung der Biosimilarität den Einsatz umfassender analytischer Methoden voraus. In der vorliegenden Arbeit wurde eine physikochemische Charakterisierung unter Verwendung von State-of-the-Art-Analytik durchgeführt, um die Masse des intakten Moleküls sowie Untereinheiten (Fc, LC und Fd) davon, post-translationalen Modifikationen, dreidimensionale Struktur und biologische Stärke der Original-Biotherapeutika Mabthera® (Roche), Enbrel® (Pfizer) und NovoSeven® (Novo Nordisk) sowie ihrer jeweiligen Biosimilare Zytux™, AryoSeven™ und Altebrel™ (AryoGen Pharmed) unter Berücksichtigung ihrer kritischen Qualitätsattribute, zu analysieren. Ein spezieller Fokus wurde dabei auf die N-Glykosylierung gelegt, da diese das Potential besitzt die Batch-zu-Batch-Konsistenz und Unterschiede während des biologischen Produktionsprozesses zu überwachen. Ein Head-to-Head-Vergleich der intakten Molekülmasse, Middle-Up-Analyse und Analytik der Untereinheiten dreier Batches Maithera® und Zytux™ zeigte ähnliche Glykoformen aber zusätzliche Lysin (Lys)-Varianten im Biosimilar. Die N-Glykosylierungsstelle Asn301 wurde sowohl für das Referenzprodukt als auch dem Biosimilar bestätigt. Die post-translationalen Modifikationen und dreidimensionale Struktur des Referenzproduktes sowie Biosimilars wurden als vergleichbar nachgewiesen. Jedoch zeigte der Vergleich der N-Glykosylierungsprofile dreier Batches des Biosimilars und Referenzproduktes quantitative aber keine qualititativen Unterschiede. Zudem wurden die funktionellen Eigenschaften verglichen, um den Einfluss der Unterschiede in der Glykosylierung und der post-translationalen Modifikationen auf die Wirksamkeit der Biosimilar-Batches im Vergleich zum Referenzprodukt zu untersuchen. Die Daten bestätigen, dass die detektierten Unterschiede innerhalb des Toleranzbereiches für den Biosimilar liegen. Die Eptagog alfa Biotherapeutika wurden physikochemisch mittels massenspektrometrischer Methoden auf intakte Masse, post-translationaler Modifikationen und dreidimensionaler Struktur analysiert. Die Analyse der N-Glykopeptide mittels UHPLC-QTOF-MSE identifizierte alle N-Glykosylierungs- und zwei O-Glykosylierungsstellen. Es konnte gezeigt werden, dass Ser60 O-fucosyliert und Ser52 O-Glucose oder O-Glucose-(Xylose)1,2 Motive als Glykan-Varianten trägt. Die N-Glykanprofile beider Biotherapeutika (NovoSeven®, AryoSeven™) besitzen Batch-zu-Batch Schwankungen. Ionenmobilitäts-Spektrometrie und NMR-Spektroskopie bestätigen die Ähnlichkeit der dreidimensionalen Struktur beider Biotherapeutika. Die Wirksamkeit beider Biopharmazeutika wurde mittels eines Koagulations-Tests analysiert und zeigte eine vergleichbare Bioaktivität. Die Physikochemische Charakterisierung mittels State-of-the-Art-Analytik wurde für den Vergleich des Etanercept Referenzprodukt Enbrel® und seinem Biosimilar AltebrelTM verwendet. Die Analyse der intakten Masse und der Untereinheiten zeigte eine Gesamtmasse von etwa 126 kDa je Dimer für beide Biotherapeutika. Die Glykoproteinspezien der kompletten Monomeer sowie der Fc-Region des Referenz-Produktes und Biosimilars waren, bis auf geringe Unterschiede in den Lys-Varianten sowie der Oxidation, ähnlich. Die N-Glykopeptid-Analyse mittels UHPLC-QTOF-MSE bestätigte die N-Glykosylierungsstellen (Asn149, Asn171 und Asn317) sowie die Fc-spezifische Glykosylierung von Asn317. Zudem zeigte diese die Tumornekrosefaktor-Rezeptor (TNFR)-spezifschen hochsialyierten Glykane an Asn149 und Asn171 im Falle beider Biotherapeutika. Die N-Glykanprofile zeigten geringe quantitative aber keine qualitativen Unterschiede. Es konnten vier verschiedene O-Glykopeptide, die core 1-Typ-Glykane tragen, delektiert werden. Die N- und O-Glykopeptidanalyse wurde entgegen der aktuellen Literatur ohne vorherige Abspaltung der Sialinsäuren erfolgreich durchgeführt. Zudem bestätigte die Ionenmobilitäts-Spektrometrie eine große Ähnlichkeit der dreidimensionalen Struktur beider Biotherapeutika. Ein Neutralisationstest sollte den Einfluss der gefundenen Unterschiede in den post-translationalen Modifikationen auf die Wirksamkeit untersuchen. Dieser zeigte, dass die Unterschiede in allen Batches innerhalb des Toleranzbereiches des Biosimilars liegen.
