Immersionsfixierungen von Mäuse- und Rattennieren ermöglichen nur eine ungenügende Strukturerhaltung für licht- und elektronenmikroskopische Auswertungsansätze, als Goldstandard gilt daher die Perfusionsfixierung. Etablierte Protokolle hierfür wurden in früheren Arbeiten für Glutaraldehyd-haltige Fixierlösungen erstellt, welche sich jedoch allgemein nicht für immunhistochemische Präparationen eignen. Hierfür müssen üblicherweise separate Versuchstiergruppen mit Formaldehyd-haltigen Fixierlösungen per Immersion oder Perfusion fixiert werden, was in beiden Fällen häufig mit starken qualitativen Einschränkungen der Strukturerhaltung verbunden ist. Aufgrund der verbesserten Generierung von immer neuen experimentellen Tiermodellen und neuen mikroskopischen Auswertungsansätzen wie Konfokalmikroskopie und Super-Resolution-Lichtmikroskopie besteht daher ein immer größer werdender Bedarf an hochwertig fixiertem Nierengewebe für immunhistochemische sowie ultrastrukturelle Auswertungen. Um sämtliche konventionellen licht- und elektronenmikroskopischen Methoden sowie auch immunhistochemischen und biochemischen Methoden anhand von nur einem Versuchstier durchführen zu können, optimierte ich im Rahmen meiner Dissertation die Zusammensetzung von Formaldehyd-haltigen Fixierlösungen für Perfusionsfixierungen von Mäusen und Ratten durch Anpassung der Vehikelosmolarität, des kolloidosmotischen Drucks, des Puffersystems und des Fixans. Durch diese optimierte Fixierung erreichte ich eine hochwertige Strukturerhaltung von Rinde und äußerem Mark durch zwei Standardprotokolle (Protokoll 1 mit Zusatz von Hydroxyethylstärke, Protokoll 2 ohne Zusatz von Hydroxyethylstärke), welche mit einem klassischen Protokoll zur Perfusionsfixierung mit Glutaraldehyd verglichen wurden (Protokoll 3 mit Zusatz von Hydroxyethylstärke). Im Rahmen von Variationen dieser Protokolle konnte durch verringerte Vehikelosmolarität die ultrastrukturelle Darstellung von Podozyten und kortikalen Tubuli optimiert werden, während sich eine hohe Vehikelosmolarität und ein hoher kolloidosmotischer Druck allgemein für gute Strukturerhaltung des äußeren Marks eigneten. Zusätzlich optimierte ich die Auswertung von Nierengewebe durch Anpassung der Gewebe- und Schnittpräparation sowie der verwendeten mikroskopischen Techniken. Hierfür stellte ich durch neue Präparationsansätze qualitativ hochwertige Ultradünnschnitte für großflächige Digitalisierungen mit dem Transmissionselektronenmikroskop und neuartigen Techniken per Rasterelektronenmikroskop her. Dies erhielt den räumlichen Zusammenhang komplexer Nierenstrukturen wie Glomeruli von der Übersicht bis zum hochauflösenden Detail und ermöglichte damit eine stufenlose Vergrößerung. Die Nutzung von Siliziumplättchen als Trägermaterial für Ultradünnschnitte im Rasterelektronenmikroskop zeigte viele Vorteile im Vergleich zu klassischen Grids bei der Verwendung im Transmissionselektronenmikroskop; sie vereinfachten die Probenpräparation, erhöhten drastisch die Stabilität der Präparate und ermöglichten eine großflächige Abbildung barrierefreier Ultradünnschnittareale. Die Digitalisierung von Ultradünnschnittarealen per Rasterelektronenmikroskop konnte durch Verwendung eines neuartigen Mehrstrahl-Rasterelektronenmikroskops darüber hinaus um das ca. 100-fache beschleunigt werden, wodurch komplette Ultradünnschnitte innerhalb von ca. 30 min. in guter Qualität digitalisiert wurden.
Immersion fixation of rodent kidneys leads to poor structural preservation for light- and electron microscopical analysis. Thus, perfusion fixation represents the goldstandard. Therefore, protocols for glutaraldehyde containing fixative solutions were established by previous authors for optimized structural preservation of rodent kidneys. Glutaraldehyde-fixed tissue, however, is generally not suitable for immunohistochemical approaches. Therefore, separate animal groups are usually used to perform formaldehyde fixation via immersion or perfusion, both associated with severe drawbacks in structural preservation. Based on today’s versatile experimental animal models and innovative microscopy techniques, such as confocal microscopy and superresolution microscopy, there is an increasing demand on high quality fixed tissue for combined immunohistochemical and ultrastructural analysis. My aim was to provide high quality fixed tissue as a basis for all conventional light- and electron microscopical techniques as well as immunohistochemical and biochemical techniques using one single animal. Therefore, I optimized fixation solutions for perfusion fixation of mice and rat kidneys by adapting vehicle osmolarity, colloidosmotic pressure, buffer solution and fixative type. Based on this improved fixation, renal cortex and outer medulla were preserved with superior quality using two standard protocols (protocol 1 containing hydroxy ethyl starch and protocol 2 without addition of hydroxy ethyl starch). Morphology was compared to a standard protocol, containing glutaraldehyde and hydroxy ethyl starch (protocol 3). Variations of these protocols with reduced vehicle osmolarity improved ultrastructural preservation especially of podocytes and cortical proximal tubular epithelium cells, whereas raised vehicle osmolarity and colloid osmotic pressure improved ultrastructural preservation of medullary components. In addition, improvements of tissue processing and section preparation further increased overall quality. By combining new approaches in transmission- and scanning electron microscopy with my adapted tissue processing protocols, I was able to digitize large thin section areas with superior quality as compared to conventional approaches. As a result, complex microanatomical architecture was preserved in the digitized datasets, facilitating smooth zooming. Compared to traditional transmission electron microscopy, improvements of thin section processing were mainly based on a more stable preparation using silicon substrate and imaging using a scanning electron microscope. Thin section digitization was further sped up using a new and powerful multi-beam scanning electron microscope by approximately 100-fold, enabling whole thin section digitization in about 30 min. with satisfactory quality.
