Fragment-basierte Ansätze zur Entwicklung neuer Arzneistoffe erfreuen sich immer größerer Beliebtheit. Dies liegt darin begründet, dass bereits durch den Einsatz und die Kombination von verhältnismäßig kleinen Fragment-Bibliotheken ein großer chemischer Raum abgedeckt werden kann. Als Startpunkt dient dabei meist ein Primärfragment, das durch geschicktes Anhängen weiterer funktioneller Gruppen oder durch Verknüpfung (Ligation) mit weiteren Fragmenten so erweitert wird, dass neue Interaktionspunkte mit der jeweiligen Zielstruktur entstehen. Hierdurch ist die Bildung hochaffiner Liganden möglich. In der vorliegenden Arbeit wird die Amidierung als irreversible Form der Ligation zweier Fragmente näher untersucht. Die Arbeit gliedert sich dabei in zwei Teile. Im ersten Teil wurde ein Ligationsassay entwickelt, bei der die Amidierung Templat-unterstützt im Stil einer Proteintarget-geleiteten Synthese durchgeführt wird. Nach vorheriger Bindung der beiden Fragmente begünstigt dabei das Templat bzw. der Templat-Effekt die Reaktion der beiden Fragmente, wenn sich deren komplementäre funktionelle Gruppen in ausreichender Nähe zueinander befinden. Als Zielprotein wurde dabei Faktor Xa eingesetzt, an dem die Ligationsreaktion eines S1-bindenden Amin-Fragments, mit einem aktivierten Carbonsäure-Fragment Templat-unterstützt, durchgeführt werden sollte. Das Produkt dieser Reaktion ist ein nanomolar-aktiver Faktor Xa-Inhibitor. Die Templat-unterstützte Amidierung wurde dabei durch Umsetzung unterschiedlich reaktiver Carbonsäurederivate (Aktivester) nachgewiesen, indem die Reaktion in An- und Abwesenheit des Proteintemplats untersucht wurde. Da im Zuge der Reaktion aus zwei millimolar-aktiven Fragmenten ein nanomolar-aktives Ligationsprodukt gebildet wird, konnte zur Detektion der Produktbildung ein Enzymaktivitätsassay verwendet werden. Dieser ermöglichte aufgrund der hohen Affinitätsunterschiede der Ausgangsfragmente im Vergleich zum Fragment-Kombinationsprodukt bereits den Nachweis kleinster Produktmengen. Für den Phenyl- und den Trifluorethylester der Carbonsäure konnte dabei eine selektiv-templierte Reaktion nachgewiesen werden, d. h. die templierte Reaktion läuft ohne gleichzeitige Reaktion durch nicht gebundene Fragmente ab (Hintergrundreaktion). Die Menge des gebildeten Produkts konnte nachfolgend mittels HPLC-QTOF-MS quantifiziert werden. Ebenfalls konnte durch die Untersuchung der Faktor Xa-Kristallstruktur mit dem co- kristallisierten Fragment-Ligationsprodukt der Reaktionsmechanismus der Reaktion auf molekularer Ebene aufgeklärt werden. Abschließend konnten Reaktionsbedingungen gefunden werden, die auch im Mikrotiterplatten-Maßstab eine erfolgreiche Umsetzung von Carbonsäuren zum entsprechenden Aktivester zulassen. Im zweiten Teil wurde ein in-situ Screening gegen die NS2B-NS3-Protease des West-Nil-Virus durchgeführt. Dabei sollte eine aus 1615 Carbonsäure Fragmenten bestehende Substanz-Bibliothek mit einem Amin-Fragment verknüpft werden. Das verwendete Amin stellte hierbei ein bekannter S1-Binder der WNV-Protease dar. Zur Ligation der Fragmente mussten zunächst geeignete Reaktionsbedingungen gefunden werden, die eine möglichst effiziente Umsetzung der Carbonsäuren zum entsprechenden Amid gewährleisten. Hierbei stellten sich die Aktivierung mittels HBTU/DIPEA in einem DMF/DMSO-Gemisch und die Aktivierung mittels DCC/DMAP in Dioxan als geeignet heraus. Nachfolgend wurde das Protease-Screening durchgeführt. Zur Detektion wurde dabei ein Fluoreszenz-basierter Enzymaktivitätsassay eingesetzt. Unterstützend wurden in-silico Methoden verwendet. Nach der Validierung der erhaltenen Ergebnisse konnten durch geeignete Hit-Selektionsschritte drei Fragment-Ligationspaare ausgewählt werden, die in größerem Maßstab nachsynthetisiert wurden und anschließend näher untersucht wurden. Für die aussichtsreichste Fragment-Kombination CA3-Amid konnte dabei ein IC50 -Wert von 2,66 µM ermittelt werden.
Fragment-based drug discovery approaches are getting popular more and more. This is due to fact that despite using and combining relatively small fragment-libraries a broad chemical space can be covered. In most cases a primary fragment is used as a starting point which consecutively gets expanded by further functional groups or through the ligation with another fragment. Thereby additional interactions with the target structure can be formed that can finally lead to the formation of highly active ligands. In the presented work, the use of the amidation reaction is investigated to link two fragments irreversibly. The work is divided into two parts. In the first part a ligation assay was developed that uses the template-assisted amidation in a “target-guided-synthesis” reaction. Here, the protein template accelerates the reaction of two fragments if both are bound to the template and if the complementary functional group of the two fragments are in the right orientation to each other. Factor Xa was thereby used as a test system. This factor Xa-template was subsequently used to establish a method to link an S1- binding amine fragment to an activated carboxylic acid fragment. The reaction of the two fragments, here, leads to the formation of a nanomolar-active factor Xa inhibitor. To investigate the occurrence of a template-assisted reaction several active esters were synthesized, covering a broad spectrum of reactivity. These synthesized esters were subsequently tested to react in a template-assisted manner with the amine fragment in presence of the protein template. The reaction in abscence of the protein-template was used as a control. Since in the course of the ligation reaction two millimolar-active fragments are linked together to form a nanomolar-active ligation product, the formation of the product can be detected highly sensitively through the use of an enzyme activity assay. In the case of the phenyl- and trifluoroethyl-ester a selective templated reaction was demonstrated without the formation of the ligation product through unbound fragments (background reaction). In later experiments the amount of the formed product was quantified via HPLC-QTOF-MS. Furthermore using the crystal structure with the co-crystallized ligation product the reaction mechanism of the templated amidation reaction have been clarified. Finally, reaction conditions were found that allow the formation of active esters from carboxylic acids in microtiter plates. In the second part an in-situ screening against the NS2B-NS3 protease of the west-nile virus was conducted. Firstly, a library containing 1615 carboxylic acid fragments were supposed to be linked to an amine fragment. In this case the used amine fragment was a known S1-binding ligand of the WNV protease. In the starting experiments several reaction conditions were investigated to find an efficient way to convert the carboxylic acids to the respective amides. The activation via HBTU/DIPEA in a DMF/DMSO- mixture and the activition with DCC/DMAP in dioxane were found to be effective and were subsequently used for the protease screening. To detect inhibiting amides an enzyme activity assay was performed using a fluorogenic substrate. As a support in-silico methods were used. After the validation of the identified screening hits using several hit selection approaches, three different hit-structure groups were chosen. One compound representing each group was synthesized in a larger scale and further investigated. For the best fragment-combination CA3-Amid, an IC50 -value of 2.66 µM was found.
