dc.contributor.author
Stutika, Catrin
dc.date.accessioned
2018-06-07T16:19:29Z
dc.date.available
2016-12-08T12:40:59.789Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/2377
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-6578
dc.description.abstract
Adeno-associated viruses (AAVs) exhibit a complex biphasic life cycle in cell
culture, with productive replication dependent upon co-infection with a helper
virus, whereas in the absence of a helper virus AAV latency is established.
While vectors based on adeno-associated viruses are already widely used in
human gene therapy, open questions remain concerning the regulation of AAV
productive and latent infection, especially in the in vivo situation, for
which no suitable animal model exists so far. To fill this gap, a combination
of in vitro and in silico analyses were chosen in the present thesis to
perform a comprehensive analysis of the AAV transcriptome based on state of
the art, high-throughput total genomic RNA sequencing. The analysis of the
transcription profiles and kinetics of the AAV (+) strand largely confirmed a
variety of previous studies performed with classical RNA methods. However,
several novel AAV splice variants were identified, the most abundant of which
led to the expression of an 18 kDa Rep/VP fusion protein. Genetic analyses
with corresponding virus mutants unable to express the newly identified splice
variants showed that these have a major impact on early AAV replication steps,
highly suggestive of an important role for in vivo AAV propagation. Maybe even
more interesting, the AAV transcriptome analysis revealed for the first time
the expression of transcripts derived from the AAV (-) strand. These
transcripts were encoded in the p5 promoter region, which drives the
expression of the large AAV2 regulatory proteins Rep78/68. The pattern of p5
sense and antisense transcription was highly reminiscent of a phenomena
described in recent years as bidirectional transcription. This adds a further
possible mechanistic level to the regulation of p5 driven gene expression,
which represents a major switch point between productive and latent AAV
infection. To identify small RNAs with regulatory roles in the AAV life cycle,
the first AAV small RNA-Seq analysis was performed in AAV infected cells. A
variety of novel AAV2-specific small RNAs located close to or within the AAV-
ITRs was identified, which are apparently transcribed from the newly defined
anti-p5 promoter. Validation on Northern blots and by argonaute Co-IP
indicated alternative small RNA processing, divergent from the canonical miRNA
pathway. In addition, small AAV2-specific RNAs in close proximity to viral
promoters were suggestive of small promoter-associated RNAs that might act as
transcriptional regulators during AAV latent and productive infection.
Furthermore, the cellular miRNA expression profile showed no alteration upon
AAV infection reassuring the long-established apathogenic nature of wild-type
AAV. As a further prerequisite for a better understanding of AAV vector
biology, the individual HSV helper genes for productive AAV5 replication were
analyzed in a comparative study of the AAV2 and AAV5 replication cycle. This
analysis revealed that the same combination of HSV1 helper genes identified
for AAV2, promote AAV5 productive replication.
de
dc.description.abstract
Adeno-Assoziierte Viren (AAV) besitzen einen komplexen biphasischen in vitro
Lebenszyklus. Für die produktive Replikation ist AAV auf die Co-Infektion
eines Helfervirus angewiesen, während in Abwesenheit eines Helfervirus der
latente Zyklus eingeleitet wird. Während von Adeno-Assoziierten Viren
abgeleitete Vektoren bereits weitreichend in der humanen Gentherapie
eingesetzt werden, bestehen noch offene Fragen bezüglich der Regulation des
produktiven und latenten AAV Infektionszyklus, insbesondere zur Regulation in
vivo, wofür bisher noch kein geeignetes Tiermodel existiert. Um diese Lücke zu
schließen, wurde in der vorliegenden Doktorarbeit eine Kombination aus in
vitro und in silico Experimenten angewendet um eine umfassende Analyse des
AAV-Transkriptoms durchzuführen, basierend auf einer der aktuellsten RNA-
Analysetechniken, der Hochdurchsatz-Sequenzierung (NGS). Die Analyse des
Transkriptionsprofils und der Transkriptionskinetik des AAV (+)-Strangs
bestätigte weitgehend frühere AAV Transkriptionsstudien, welche mit
klassischen RNA-Methoden durchgeführt wurden. Darüber hinaus wurden aber auch
verschiedene neue AAV-Spleißvarianten identifiziert, wobei für die am
häufigsten vertretende Spleißvariante die Expression eines neuen 18 kDa Rep/VP
Fusionsproteins nachgewiesen werden konnte. Genetische Analysen mit
Virusmutanten, die diese neue Spleißvariante nicht exprimierten, zeigten, dass
diese einen großen Einfluss auf frühe Schritte im AAV Infektionszyklus
ausüben, was auf eine wichtige Rolle für die AAV Propagation in vivo
hindeutet. Zusätzlich wurden in der AAV Transkriptomanalyse interessanterweise
erstmalig Transkripte vom AAV (-)-Strang identifiziert. Diese Transkripte
codierten in der p5 Promoterregion, welcher die Expression der großen
regulatorischen AAV2 Proteine, Rep78/68 treibt. Das Transkriptionsprofil vom
p5 Promoter, in Sense- und Antisense-Richtung, erinnerte an ein in den letzten
Jahren beschriebenes Phänomen, bekannt als "bidirektionale Transkription".
Dieser Mechanismus könnte eine weitere Ebene für die Regulation der p5
Promoter-Genexpression darstellen, um vom latenten zum produktiven AAV
Infektionszyklus umzuschalten. Für die Identifizierung kleinerer RNAs mit
regulatorischer Funktion für den AAV Infektionszyklus wurde hier erstmalig
eine Illumina Sequenzanalyse kleiner RNAs (small RNA-Seq) von AAV-infizierten
Zellen durchgeführt. Hierbei konnten viele kleine AAV2-spezifische RNAs in
unmittelbarer Nähe bzw. innerhalb der AAV-ITRs identifiziert werden, welche
vermutlich am neu definierten anti-p5 Promoter initiieren. Durch die
Validierung mittels Northern-Blot Analyse und Argonaute Co-IP konnte der
allgemeine miRNA Prozessierungsmechanismus für die Generierung dieser kleinen
AAV2-spezifischen RNAs ausgeschlossen werden. Die unmittelbare Nähe einiger
neu detektierter kleiner RNAs zu viralen Promotern lässt allerdings vermuten,
dass es sich hierbei um kleine Promoter-assoziierte RNAs handelt, die während
des latenten und produktiven Infektionszyklus als Transkriptionsregulatoren
fungieren. Weiterhin konnte durch die Analyse des zellulären miRNA-Profils
gezeigt werden, dass AAV keinen Einfluss auf die Expression zellulärer miRNAs
nimmt, was den lang bekannten apathogenen Charakter von AAV unterstreicht.
Weiterhin wurde hier in einer vergleichenden Studie des AAV2 und AAV5
Replikationszyklus die Abhängigkeit der produktiven AAV5 Replikation von den
individuellen HSV1 Helfergenen analysiert, als eine Voraussetzung für die
Weiterentwicklung der AAV Vektor-Biologie. Dabei konnte gezeigt werden, dass
für AAV5 die gleichen HSV Helferfunktionen benötigt werden, wie für AAV2.
de
dc.format.extent
146 Seiten
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
Adeno-associated virus
dc.subject
transcription analysis
dc.subject
Next Generation Sequencing
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik
dc.title
Comprehensive Analysis of the Adeno-Associated Virus (AAV) Transcriptome Based
on Next Generation Sequencing Reveals New Insights into AAV Biology
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Regine Heilbronn
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Regine Heilbronn
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Rupert Mutzel
dc.date.accepted
2016-11-18
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000103635-0
dc.title.translated
Umfassende Analyse des Adeno-assoziierten Virus (AAV) -Transkriptoms mittels
Next Generation Sequencing führt zu neuen Erkenntnissen in der AAV-Biologie
de
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000103635
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000020518
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access