Endothelial tip cells in angiogenic sprouts direct branching of vascular networks. Specification of tip cells involves tight spatiotemporal control of Dll4-Notch signaling. MicroRNAs repress gene expression through binding with the 3’UTR of target mRNA. Computational analyses predict a highly conserved interaction of microRNA-30 (miR-30) family members with dll4-3’UTR but their contribution in regulating endothelial Dll4 and vascular branching morphogenesis is unknown. Through deep sequencing and functional screening in zebrafish model, we identified endothelial miR-30a as an essential regulator for angiogenesis. The miR-30 family consists of 5 members (miR-30a-e), and loss-of-function approaches in zebrafish embryos showed that only loss of miR- 30a significantly reduced sprouting of intersegmental artery sprouts, and impaired tip cell filopodial extensions. Overexpression of miR-30a stimulated angiogenic cell behavior, and hyperbranching of intersegmental artery sprouts. In vitro and in vivo reporter assays demonstrated that miR-30a directly targets dll4, and co-administration of dll4 morpholino in miR-30a morphant embryos rescued branching deficits. Conversely, conditional overactivation of Notch signaling by overexpressing Notch-intracellular domain (NICD) restored vessel branching in miR-30a gain-of-function embryos. Furthermore, in human endothelial cells, loss of miR-30a increased DLL4 protein levels, overactivated NOTCH signaling as indicated in NOTCH reporter assays, and augmented expression of NOTCH downstream effectors Hey2 and EFNB2. In spheroid assays, miR-30a loss-of-function and gain-of-function affected angiogenic cell behavior consistent with miR-30a targeting DLL4. Taken together, these findings uncover a novel molecular mechanism that endothelial miR-30a acts as an evolutionarily conserved positive regulator to control angiogenic cell behavior and vessel branching by targeting dll4 and inhibiting Notch signaling.
Die Sproßung von endothelialen Zellen wird durch sogenannte “tip cells” geleitet welche somit das Verzweigungsmuster des Gefäßnetzwerkes bestimmen. Die Spezifizierung der “tip cell” erfolgt durch eine räumliche und zeitliche Regulation des Dll4-Notch-Signalweges. “Micro-RNAs” inhibieren die Genexpression durch Bindung an die 3´-UTR der Ziel-mRNA. In silico Analysen weisen auf eine hoch konservierte Interaktion der “micro-RNA” (miR-30) Familie mit der Dll4-3´-UTR hin. Eine Beeinflussung von endothelialem Dll4 und damit einhergehender Regulation der Gefäßmorphogenese ist unbekannt. Durch “deep sequencing” und eines funktionalen Screens im Zebrafischmodel identifizierten wir endotheliale miR-30a als essentiellen Angiogeneseregulator. Die miR-30 Familie besteht aus fünf Mitgliedern (miR-30a-e). Die Depletion dieser zeigte, dass nur der Verlust von miR-30a zu einer signifikanten Reduktion der Sprossung von intersegmentalen Arterien (ISA) führte. Überexpression von miR- 30a führte zu einer verstärkten Verzweigung von ISAs. In vitro und in vivo Reporterassays demonstrierten das miR-30a direkt dll4 angreift. Eine gleichzeitige Administration von dll4 Morpholino mit miR-30a stellte das normale Verzweigunsmuster von ISAs wieder her. Die Aktivierung des Notchsignalweges durch eine Überexpression der Notch-intrazellulären Domäne stellte einen normalen Gefäßphenotyp in miR-30a überexprimierten Embryonen wieder her. Desweiteren konnte in humanen Endothelzellen gezeigt werden, dass eine miR-30a Defizienz zu erhöhten DLL4 Proteinleveln führt, den Notchsignalweg verstärkt aktiviert und dadurch die Notcheffektoren Hey2 und EFNB2 vermehrt exprimiert werden. In “spheroid-assays” führte miR-30a Überexpression und Depletion zu verändertem Gefäßwachstum, welches konsistent mit einer Interaktion von miR-30a mit DLL4 ist. Zusammengenommen konnten wir einen neuen molekularen Regulationsmechanismus aufzeigen: endotheliale miR-30a ist ein evolutionär konservierter positiver Regulator des Gefäßwachstums, speziell der Gefäßverzweigung, durch Interaktion mit dll4 und damit einhergehender Inhibierung des Notchsignalweges.
