Das zentrale Ereignis in der Verarbeitung von Zytokinsignalen ist die Phosphorylierung von STAT-Proteinen, die dadurch in DNS-bindende Transkriptionsfaktoren umgewandelt werden. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die DNS-Bindung von zwei STAT1-Varianten mit Mutationen in der DNS-Bindedomäne untersucht. Die T327R-Mutante zeigte eine verlängerte und unspezifische DNS- Bindung, die ihre in Vorversuchen beobachtete verlängerte Kernretention und transkriptionelle Inaktivität vollständig erklärt. Die H406A-Mutante hingegen war dem Wildtyp in der DNS-Bindungsspezifität sehr ähnlich. Allerdings könnte diese Mutation die zur Dephosphorylierung benötigte antiparallele Dimerkonformation destabilisieren und so die gesteigerte transkriptionelle Aktivität der Mutante erklären. Aufgrund der wichtigen Rolle der Dimerumlagerung bei der STAT-Inaktivierung wurde im zweiten Teil dieser Arbeit der Einfluss der Tyrosin-Phosphorylierung auf die Stabilität und Konformation von STAT1-Dimeren erstmalig untersucht. Durch analytische Ultrazentrifugation stellte sich heraus, dass STAT1 unabhängig vom Phosphorylierungsstatus hoch- affine Dimere identischer Stabilität (Kd ca. 50 nM) mit Halbwertszeiten von ca. 20-50 Minuten bildet. Während das unphosphorylierte Dimer über die N-Domänen stabilisiert wurde, interagierte das phosphorylierte STAT1 über die SH2-Domänen. In EMSA-Experimenten wurde demonstriert, dass die Tyrosin- Phosphorylierung nicht zur DNS-Bindung benötigt wird. Allerdings erhöhte sich durch STAT1-Aktivierung die Menge der SH2-Domäne-vermittelten Dimere und somit die DNS-Bindeaktivität mehr als 200-fach. Demnach koexistieren unabhängig vom Phosphorylierungsstatus zwei Dimerkonformationen, die sich durch Dissoziation und Reassoziation ineinander umwandeln. Zudem nehmen die N-Domänen nach STAT1-Aktivierung eine offene Konformation ein, die durch Inter-Dimer- Interaktionen die Tetramerisierung von STAT1 ermöglicht. Erstaunlicherweise sind homotypische N-Domänen-Interaktionen jedoch in der STAT-Familie nicht konserviert, da die Kd-Werte der isolierten N-Termini von STAT1, -3 und -4 um den Faktor 1000 variierten. Meine Daten zeigen, dass STAT1 zwischen verschiedenen Dimerkonformationen oszilliert und deren Häufigkeit durch Tyrosin-Phosphorylierung reguliert wird. Für diesen dynamischen Prozess wird ein auf den Resultaten dieser Arbeit basierendes Modell vorgestellt, das mit vorliegenden Kristallstrukturen kompatibel ist und vermutlich paradigmatisch für die STAT-Familie ist.
The central event in the transduction of cytokine signals is the phosporylation of STAT proteins which thereby convert into DNA binding transcription factors. In the first part of this work, the DNA binding of two STAT1 variants with mutations in the DNA binding domain was analysed. The T327R mutant showed prolonged and unspecific DNA binding that completely explains its prolonged nuclear retention and transcriptional inactivity as was observed in previous experiments. The H406A mutant on the other hand was very similar to the wildtype with respect to DNA binding specificity. However, this mutation might destabilize the antiparallel dimer conformation, which is required for dephosphorylation, and this might explain the increased transcriptional activity of the mutant. Due to the important role of dimer rearrangement for STAT inactivation, the influence of tyrosine phosphorylation on dimer stability and conformation of STAT1 dimers was analysed in the second part of this work for the first time. Analytical ultracentrifugation revealed that STAT1 forms high-affinity dimers of equal stability (Kd ca. 50 nM) with half-life times of 20-50 minutes, irrespective of the phosphorylation state. Whereas the unphosphorylated dimer was stabilized by N-domain interactions, the phosphorylated STAT1 interacted via its SH2 domains. EMSA experiments demonstrated that tyrosine phosphorylation is dispensable for DNA binding. However, STAT1 activation increased the amount of SH2 domain-mediated dimers and thus enhanced the DNA binding activity of STAT1 more than 200-fold. Hence, irrespective of the phosphorylation state two dimer conformations coexist that convert into each other via dissociation and reassociation. Moreover, upon STAT1 activation the N-domains adopt an open conformation that facilitates tetramerization of STAT1 via inter-dimer interactions. Surprisingly, homotypic N-domain interactions are not conserved in the STAT family, because the Kd values of the isolated N-termini of STAT1, -3 and -4 varied by a factor of 1000. My data demonstrate that STAT1 oscillates between different dimer conformations and tyrosine phosphorylation regulates the abundance of the conformations. Based on the results of this work, a model for this dynamic process is introduced that is compatible with existing crystal structures and that may serve as a paradigm for the STAT family.
