Die vorliegende Arbeit beschreibt Studien zur Funktion der GNE, des Schlüsselenzyms der Biosynthese von Sialinsäuren. Die GNE bzw. Sialinsäuren sind essentiell für den Organismus, da GNE-defiziente (KO-) Mäuse embryonal lethal sind. Das Augenmerk dieser Arbeit liegt auf der Aufklärung der Regulation dieses Enzyms über seine verschiedenen oligomeren Zustände und auf der Identifizierung interagierender Proteine. Des Weiteren werden embryonale Stammzellen (ES-Zellen), die bezüglich der GNE-defizient sind, isoliert und näher charakterisiert. Mittels Y2H-System wurde die Kinasedomäne der GNE als wichtige Komponente für die Oligomerisierung identifiziert. Außerdem konnten mittels Y2H-Screening gegen eine cDNA-Genbank aus fötalem humanem Hirn vier interagierende Proteine isoliert werden. Diese vier Proteine sind CRMP-1, PLZF, RIF 1 und KIAA 1549. Die Interaktion von CRMP-1 mit GNE konnte durch Co- Immunpräzipitationen bestätigt werden. Ebenso konnte die Interaktion von PLZF mit GNE durch pull down-Assays bestätigt werden. Nach der Isolation embryonaler Stammzellen wurden diese zunächst genotypisch mittels PCR und biochemisch mittels Enzym-Assay charakterisiert. Anschließend wurden ihre Stammzellmarker bestimmt, um die Pluripotenz der Zellen sicherzustellen. Des Weiteren wurden WT- und KO-ES-Zellen unter serumhaltigen und serumfreien Bedingungen kultiviert und bezüglich ihrer Sialinsäurekonzentration (Resorcinol-Assay) und Oberflächensialylierung (FACS) miteinander verglichen. Anschließend wurden die KO-ES-Zellen mit dem Sialinsäurevorläufer ManNAc inkubiert, um das Defizit an Sialinsäuren auszugleichen. Dabei wurde herausgefunden, dass eine Konzentration von 1-3 mM ManNAc ausreichend ist, um die Sialylierung der KO-ES-Zellen auf das Niveau der WT-ES-Zellen anzuheben. Die Proliferation der ES-Zellen wurde ebenfalls unter verschiedenen Kulturbedingungen untersucht, wobei kein Unterschied zwischen WT- und KO-ES- Zellen festgestellt werden konnte.
The available work describes studies for the function of the bifunctional enzyme GNE, the key enzyme of the biosynthesis of sialic acids. The GNE and/or sialic acids are essential for the organism, since GNE deficient (KO-) mice are embryonic lethal. This work focuses on the elucidation of the regulation of this enzyme over its different oligomeric states and on the identification of interacting proteins. Additionally murine embryonic stem cells, which are deficient in GNE were isolated and characterized. Using Y2H system the kinase domäne of the GNE was identified as important component for oligomerization. In addition by screening a cDNA gene bank from fetal human brain four interacting proteins were isolated: CRMP1, PLZF, RIF1 and KIAA1549. The interaction of CRMP1 with GNE could be confirmed by coimmunoprecipitation. Likewise the interaction of PLZF with GNE could be verified by pull down assays. After the isolation of murine embryonic stem cells these were characterized first genotypically using PCR and biochemically using radioactive enzyme assay. Subsequently, they were examined for their stem cell markers, in order to guarantee the pluripotency of these cells. WT and KO cells were cultivated under FCS containing and serum-free conditions and were compared concerning their sialic acid content (resorcinol assay) and cell surface sialylation (FACS). Subsequently, KO stem cells were incubated with the sialic acid precursor ManNAc, in order to adjust the deficit at sialic acids. It was found out that a concentration of 1-3 mM ManNAc is sufficient, to raise the sialylation level of WT stem cells. The proliferation of stem cells was examined on different culture conditions, whereby no difference between WT and KO stem cells could be determined.
