Der fakultativ humanpathogene Pilz C. albicans besiedelt als harmloser Kommensale Haut und Schleimhäute des Menschen. Als Pathogen spielt C. albicans als Erreger von oralen Candidosen vor allem bei immunsupprimierten Patienten eine wichtige Rolle. Kommt es zu Veränderungen der lokalen Mikroflora oder zu Abschwächungen des Immunsystems, wie es z.B. bei HIV+ Patienten der Fall ist, kann es zu oralen Infektionen durch C. albicans kommen. Diese manifestieren sich durch eine massenhafte Vermehrung der Pilzzellen sowie der Invasion in oberflächennahe Bereiche des Epithelgewebes. Die zellulären und molekularen Mechanismen der Interaktionen von C. albicans während der Kolonisierung oder der Infektion des oralen Epithelgewebes sind dabei noch weitgehend unklar. Um die komplexen Vorgänge der Wirt-Pathogen Interaktionen während der Infektion zu untersuchen, wurde eine experimentelle Infektion durchgeführt und analysiert. Dazu wurde ein in vitro generiertes orales Epithelgewebe (RHE) mit C. albicans infiziert und zu verschiedenen Zeitpunkten mikroskopisch analysiert. Basierend auf der mikroskopischen Analyse wurde die experimentelle Infektion in drei Phasen unterteilt: eine frühe Adhäsionsphase (1 h), eine mittlere, invasive Phase (3-6 h) und eine späte Phase (12-24 h), welche durch eine starke Schädigung des epithelialen Gewebes gekennzeichnet war. Die frühe Phase der Interaktion war charakterisiert durch eine unmittelbare Induktion der Hyphenbildung sowie einer starken Adhäsion der Pilzzellen an das epitheliale Gewebe. Analysen der elektronenmikroskopischen Aufnahmen (REM, TEM) zeigten weiterhin, dass die Invasion der C. albicans Hyphenzellen in das Gewebe dabei sowohl über passive Mechanismen (induzierte Endozytose) als auch über aktive Mechanismen (aktive Penetration) stattfand. Die späte Phase der experimentellen Infektion war charakterisiert durch ein dichtes Myzelgeflecht, welches sich invasiv im Gewebe ausbreitete und zu einer starken Schädigung des Gewebes führte. Basierend auf den mikroskopischen Untersuchungen erfolgte weiterführend die molekulare Analyse der Interaktionen. Dazu wurden das orale Epithelgewebe über verschiedene Zeitpunkte (1, 3, 6, 12 und 24 h) mit C. albicans infiziert und die Proben mit C. albicans spezifischen Mikroarrays hybridisiert. Um die Relevanz der Daten aus den experimentellen Infektionen zu überprüfen, wurden Mikroarray-Experimente mit in vivo isolierten Patientenproben durchgeführt und die erstellten Transkriptionsprofile mit den Transkriptionsprofilen der in vitro Infektionen verglichen. Trotzdem die Transkriptionsprofile der elf Patientenproben eine unerwartet starke Heterogenität aufwiesen, konnte eine Reihe von Genen identifiziert werden, welche sowohl in den in vitro als auch den in vivo Proben ähnlich reguliert waren. In dieser Gruppe waren Gene, welche mit dem Hefe/Myzel Übergang, einer adaptiven Anpassung an ein neutrales pH-Milieu, mit der Verwertung verschiedener Kohlenstoff-Quellen sowie der Bekämpfung von nitrosativem Stress assoziiert waren. Ein weiteres Ziel der Analyse der in vivo und in vitro erstellten Transkriptionsprofile war es, Gene zu identifizieren, welche möglicherweise mit der Virulenz von C. albicans assoziiert sind. Dazu wurden acht Gene ausgewählt, welche stark und spezifisch während der frühen oder der späten Phase der experimentellen Infektion sowie in den Patientenproben exprimierte waren. Diese wurden in C. albicans ausgeschaltet und die erstellten Mutantenstämme weiterführend analysiert. Bei der Analyse der Interaktion der erstellten Mutanten mit dem RHE-Modell waren vier der Mutanten leicht bis stark attenuiert in den Fähigkeiten, Gewebeschädigungen zu induzieren. Eine Mutante, in welcher das Gen EED1 ausgeschaltet worden war, zeigte einen nahezu avirulenten Phänotyp. Das Gen EED1, welches sowohl in den Patientenproben als auch während der experimentellen Infektion eine starke Expression gezeigt hatte, stellte sich weiterhin als essentiell für die Hyphenbildung in C. albicans heraus. Delta-eed1 Mutanten waren gekennzeichnet durch eine lediglich transiente Hyphenbildung und einem daraus resultierenden, auf oberflächliche Gewebebereiche begrenzten, invasiven Wachstum. Die weiterführende Proliferation der Delta-eed1 Mutante fand in den Epithelzellen und -gewebe dabei nur noch in der Hefeform statt, so dass keine invasive Ausbreitung mehr im Gewebe stattfinden konnte. Die in dieser Arbeit gewonnen Ergebnisse zeigen, dass die Hyphenmorphologie sowie die adaptive Interaktion der C. albicans Zellen mit dem Epithelgewebe eine wichtige Rolle bei der Initiation und der Etablierung einer oralen Infektion spielen.
Candida albicans is normally a harmless commensal fungus of mucosal surfaces in healthy individuals but can cause several types of infections in predisposed patients, ranging from superficial to life-threatening disease. As the most common oral fungal pathogen of humans, C. albicans frequently causes oral infections in human immunodeficiency virus (HIV)-infected patients. During oral infections, fungal cells invade the oral mucosa and persist within the epithelium causing superficial lesions. However, the mechanisms by which C. albicans invades and persists within mucosal epithelium are not clear. To understand oral pathogenesis, cellular and molecular mechanisms of epithelial- fungus interactions were characterized using a model based on reconstituted human oral epithelial tissue (RHE). Based on the microscopical analysis of histological sections the experimental infection process was dissected into three different phases: an early attachment phase (1 h), a mid-invasion phase (3-6 h) and a late destruction phase (12 24 h). The early attachment phase was characterized by immediate hyphal formation and a strong adhesion of the fungal cells to the epithelial tissue. Furthermore, electron microscopy (SEM, TEM) revealed that hyphal formation facilitates epithelial invasion via both active (physical penetration) and passive (induced endocytosis) processes. The late phase was characterized by a dense network of hyphal cells invading and disseminating within the tissue. Only the late phase was correlated with strong tissue damage, reflected by the release of an epithelial marker enzyme (LDH). Based on these observations genome-wide transcript profiling of C. albicans was performed at five time-points (1, 3, 6, 12 and 24 h) aiming to identify phase-specific genes. To show that the data obtained from the in vitro infection model reflect the in vivo situation, transcriptional profiling of C. albicans cells isolated from patients suffering from oral Candida infections was also analyzed. Although the transcriptional profiles of the 11 patient samples showed an unexpected high heterogeneity, a set of genes was identified which were similarly regulated under in vitro and in vivo conditions. The expression profiles reflected the morphological switch and an adaptive response to neutral pH, non-glucose carbon sources and nitrosative stress. To identify genes, potentially associated with fungal virulence, eight genes were targeted to create knock-out mutants. Thereby only genes whose expression was phase-specific and/or expressed in both patients and the RHE model were chosen. All eight mutants were analyzed in the RHE model and under a number of in vitro growth conditions. Four of the mutants had moderate or strongly reduced abilities to damage epithelial tissue. One gene, up-regulated in both RHE infection and patients, named EED1, was essential for maintenance of hyphal elongation. Mutants lacking EED1 showed transient cell elongation on epithelial tissue, which enabled only superficial invasion of epithelial cells. Once inside an epithelial cell, delta-eed1 cells could proliferate as yeasts or pseudohyphae but remained trapped intracellular. These results suggest that the adaptive response and morphology of C. albicans play specific roles for host-fungal interactions during mucosal infections.
