Das auf Chromosom 1 von Arabidopsis thaliana lokalisierte Resistenzgen RPB1 vermittelt eine dominant vererbte Resistenz gegen den obligaten Wurzelparasiten Plasmodiophora brassicae. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Region, in der das RPB1-Gen in vorangehenden Arbeiten lokalisiert wurde, möglichst weit einzugrenzen, so dass ein DNA-Fragment isoliert werden kann, welches das Resistenzgen trägt und zur Transformation anfälliger Pflanzen eingesetzt werden kann. Hierfür war eine hochauflösende Kartierung der RPB1-Region notwendig. Der erste Schritt im Rahmen dieser Kartierungsarbeiten war die Erstellung eines BAC-Contigs, das den Resistenzlocus überspannt und zur Identifizierung neuer, eng gekoppelter Marker diente. Es wurden zwei BAC- Klone identifiziert, die den Resistenzlocus überspannen. Der Klon T12O21 grenzte den RPB1-Locus hierbei am engsten ein, und die vollständig veröffentlichte Sequenz dieses Klons diente der weiteren molekularen Analyse der Region. Da die BAC-Klone DNA des anfälligen Arabidopsis-Ökotyps Columbia enthalten, wurde im Hinblick auf eine weitere Eingrenzung des RPB1-Locus eine Cosmid-Bibliothek des resistenten Ökotyps Tsu erstellt, der auch zur Herstellung der Kartierungspopulation verwendet wurde. Die bereits existierende Kartierungspopulation konnte im Verlauf dieser Arbeit von 900 auf 4230 Pflanzen vergrößert werden. Zu diesem Zweck wurden zwei allelspezifische PCR-Marker etabliert, die eine schnelle Vorselektion von Pflanzen mit Rekombinationsereignissen nahe am Resistenzlocus ermöglichten. Insgesamt konnten 17 neue, eng gekoppelte RFLP- und PCR-Marker in einem Bereich von ca. 200 kb um den RPB1-Locus kartiert werden. Im letzten Abschnitt der Kartierungsarbeiten konnten einige BAC-Fragmente kartiert werden, die über einen großen Abschnitt von ca. 29 kb alle Cosegregation mit dem RPB1-Gen zeigten. Anhand der Kartierungsdaten erwies sich die RPB1-Region als ein Chromosomenabschnitt mit verringerter Rekombinationshäufigkeit ("cold spot"). Der RPB1-Locus wurde gemäß der Sequenz des Ökotyps Columbia auf einen Bereich von ca. 71 kb eingegrenzt. In diesem Abschnitt liegen drei Pseudogene und 13 codierende Sequenzen, von denen sechs in einem Abschnitt liegen, der absolute Kopplung mit dem Resistenzlocus zeigt. Die anderen sieben Gene liegen in den Abschnitten rechts und links von der cosegregierenden Region und müssen ebenfalls als Kandidatengene eingestuft werden. Aus der Tsu-Cosmidbibliothek wurde ein Cosmidklon isoliert, der drei dieser Kandidatengene enthält. Bei zwei der sechs Gene im cosegregierenden Abschnitt handelt es sich mit großer Wahrscheinlichkeit um Col-spezifische Gene, zwei andere Gene sind in duplizierter Form auf Chromosom 5 vorhanden. Keines der 13 Gene konnte einem bekannten Gen bzw. Protein zugeordnet werden oder zeigte Ähnlichkeiten zu bereits identifizierten Resistenzgenen, weshalb sie in den Datenbanken als hypothetische bzw. unbekannte Gene eingestuft wurden. In cDNA-Analysen wurde für 10 der 13 codierenden Sequenzen eine Expression in mindestens einem der beiden Ökotypen Tsu (resistent) und Cvi (anfällig) nachgewiesen. Ein Gen (CDS9) wurde sowohl bei infizierten als auch bei nicht infizierten Pflanzen nur im resistenten Ökotyp Tsu exprimiert. In Sequenzvergleichen der beiden Ökotypen Col und Tsu und in PCR-Analysen der vier Ökotypen Tsu, Cvi, RLD und Col konnte ein hoher Polymorphiegrad mit einer großen Anzahl an Einzelnukleotidpolymorhismen zwischen den einzelnen Arabidopsis-Ökotypen festgestellt werden. Mit den durchgeführten Kartierungsarbeiten und der molekularen Analyse der RPB1-Region wurde die Basis für nachfolgende Komplementationsversuche geschaffen, die zur Isolierung des RPB1-Gens notwendig sind.
The resistance gene RPB1 is located on chromosome 1 of Arabidopsis thaliana and confers a dominantly inherited resistance to the obligate biotrophic pathogen Plasmodiophora brassicae. The objective of this work was to narrow down the region where the RPB1 gene had been mapped in preceding studies as far as possible, in order to isolate a DNA fragment carrying the resistance gene, which could then be used for the transformation of susceptible plants. To achieve this, high resolution mapping studies had to be done in the RPB1-region. The first step was the construction of a BAC contig that spans the resistance locus and was used to identify new, closely linked markers. Two BAC clones which span the RPB1 locus were identified. The published DNA sequence of the smaller one of these two clones, BAC T12O21, was used for further molecular analysis of this region. Since the BAC clones carry DNA of the susceptible Arabidopsis ecotype Columbia, a cosmid library of the resistant ecotype Tsu-0 (the ecotype used for building up the mapping population) was created. The existing mapping population was expanded from 900 to 4230 plants. Two allelspecific PCR markers were established that permitted a quick preselection of plants with recombination events near the RPB1 locus. Altogether 17 new closely linked RFLP and PCR markers were mapped in a section of 200 kb around the resistance locus. In the last part of the mapping studies some BAC fragments showing cosegregation with the resistance locus in a large section of approximately 29 kb could be mapped. According to these mapping data the RPB1-region is a section on chromosome 1 with a reduced number of recombination events (cold spot). The RPB1 locus was narrowed down to a region of approximately 71 kb according to the Col sequence. In this section three pseudogenes and 13 coding sequences were located. Six of these 13 candidate genes were placed in the region that showed cosegregation with RPB1. The other seven genes were placed in the regions to the left and to the right of this cosegregating region and have to be classified as candidate genes too. One cosmid clone was isolated from the Tsu library that carries three of these candidate genes. Two of the six genes in the cosegregating section are very probably Col specific, two other genes are duplicated on chromosome 5. None of the 13 coding sequences match known genes or proteins or have similarities to previously identified resistance genes. Therefore these genes were classified as hypothetical or unknown genes in the databases. In cDNA analyses 10 of these 13 coding sequences were confirmed to be expressed in at least one of the two ecotypes Tsu (resistant) and Cvi (susceptible). One gene (CDS9) was exclusively expressed in the resistant ecotype Tsu in both infected and non- infected plants. A high rate of polymorphism with a large number of single- nucleotide-polymorhisms between the individual ecotypes could be detected by sequence comparison of the two ecotypes Tsu and Col or PCR analyses of the four ecotypes Tsu, Cvi, RLD and Col. The high resolution mapping and the molecular analysis of the RPB1-region can now serve as the basis for subsequent complementation studies that will be necessary for isolating the RPB1 gene.
