id,collection,dc.contributor.author,dc.contributor.firstReferee,dc.contributor.furtherReferee,dc.contributor.gender,dc.date.accepted,dc.date.accessioned,dc.date.available,dc.date.issued,dc.description,dc.description.abstract[de],dc.description.abstract[en],dc.format.extent,dc.identifier.uri,dc.identifier.urn,dc.language,dc.rights.uri,dc.subject,dc.subject.ddc,dc.title,dc.title.translated[en],dc.type,dcterms.accessRights.dnb,dcterms.accessRights.openaire,dcterms.format[de],refubium.affiliation[de],refubium.mycore.derivateId,refubium.mycore.fudocsId "919a90c0-701a-4fae-b68e-a5a1ea063193","fub188/14","Dathe, Dorothea Christin","Prof. Dr. Sebastian Bachmann","Prof. Dr. Burghardt Wittig","w","2014-02-13","2018-06-07T19:29:38Z","2014-03-27T08:16:17.958Z","2014","Danksagung I Inhaltsverzeichnis II Abkürzungsverzeichnis VI 1 Einleitung 1 1.1 Anatomie und Funktionen der Niere 1 1.2 Natrium-Kalium-Chlorid-Kotransporter Typ 2 3 1.2.1 Wirkungsweise von NKCC2 im Kontext der TAL-Funktion 3 1.2.2 Expression, Struktur und Phosphorylierungen von NKCC2 5 1.2.3 Regulation der Aktivität von NKCC2 7 1.2.4 Verteilung von NKCC2 innerhalb der Zelle 8 1.2.5 NKCC2 in Lipid Rafts 9 1.3 Annexin A2 und P11 10 1.3.1 Struktur von ANXA2 11 1.3.2 Komplex aus ANXA2 und P11 13 1.3.3 Lokalisation von ANXA2 in der Niere 16 1.4 Fragestellung und methodischer Ansatz 17 2 Material und Methoden 19 2.1 Tierexperimentelle Arbeiten 19 2.1.1 Versuchstiere und Behandlung 19 2.1.2 Brattleboro Ratten 19 2.2 Organentnahme und Gewebepräparation 20 2.2.1 Perfusionsfixierung und Gewebeaufbereitung für Immunhistochemie 20 2.2.1.1 Herstellung von Kryostatschnitten 20 2.2.1.2 Herstellung von Paraffinschnitten 21 2.2.2 Gewebeaufbereitung für biochemische Analysen 21 2.2.2.1 Gewebeaufbereitung zur Genexpressionsanalyse 21 2.2.2.2 Gewebeaufbereitung für Immunpräzipitation und Lipid Raft-Präparation 21 2.3 Proteinanalytische Methoden 22 2.3.1 Immunhistochemie 22 2.3.2 Immunzytochemie 22 2.3.3 Transmissionselektronenmikroskopie 23 2.3.3.1 Ultrastrukturelle Analyse der Lipid Rafts 23 2.3.3.2 Präparation von Plasmamembran-Sheets und Immunogoldmarkierung 23 2.3.4 Separation von Zytosol und Plasmamembran 24 2.3.5 Lipid Raft-Präparation 25 2.3.6 Immunpräzipitation 25 2.3.7 SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Western Blot 26 2.3.7.1 Bestimmung der Proteinkonzentration mit der BCA-Methode 26 2.3.7.2 SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese 26 2.3.7.3 Coomassie-Färbung 27 2.3.7.4 Silberfärbung nach Heukeshoven und Dernick (1988) 28 2.3.7.5 Immunblotting 28 2.3.8 Massenspektrometrische Analyse 29 2.3.9 Expression und Affinitätschromatographie von GST-Fusionsproteinen 30 2.3.10 Peptid Spot Array 31 2.3.10.1 Proteolytische Spaltung und Säulen-Chromatographie von Fusionsproteinen 31 2.3.10.2 Herstellung und Durchführung der Peptid Spots 31 2.3.11 GST-Pulldown 32 2.4 Molekularbiologische Methoden 32 2.4.1 Genexpressionsanalyse 32 2.4.1.1 RNA-Isolation mittels Trizol 32 2.4.1.2 cDNA Synthese mittels Reverser Transkription 33 2.4.1.3 Quantitative Real-Time PCR mit EvaGreen® 33 2.4.2 Klonierung 34 2.4.2.1 Klonierungs-PCR 34 2.4.2.2 Kolonie-PCR 36 2.4.2.3 Agarose-Gelelektrophorese und Gelextraktion 37 2.4.2.4 Restriktionsverdau 37 2.4.2.5 Ligation 38 2.4.2.6 Transformation kompetenter Bakterien mittels Hitzeschock 38 2.4.2.7 Präparation der Plasmid-DNA und Sequenzierung 39 2.5 Zellkultur und Transfektion 39 2.5.1 Zelllinien 39 2.5.2 Transfektion von Expressionsplasmiden 39 2.5.3 RNA-Interferenz 40 2.5.4 Stimulation der Zellen 40 2.5.4.1 Hypotonischer Chloridmangel-Stress 40 2.5.4.2 Behandlung mit PMA und Dynasore 41 2.5.5 Biochemische Aufbereitung der Zellkultur 41 2.6 Statistik 41 2.7 Material 41 2.7.1 Antikörper 41 2.7.2 Enzyme und zugehörige Agenzien 43 2.7.3 Kits 43 2.7.4 Chemikalien und Reagenzien 43 2.7.5 Materialien und Chemikalien der Zellkultur 45 2.7.6 Verbrauchsmaterial 45 2.7.7 Geräte 46 2.7.8 Software 47 3 Ergebnisse 48 3.1 NKCC2 als Lipid Raft-Protein –Assoziation mit Flotillin-1 und THP 48 3.2 Identifikation von ANXA2 als möglichen Interaktionspartner von NKCC2 in Lipid Rafts 50 3.2.1 Etablierung und Validierung der NKCC2-Immunpräzipitation 51 3.2.2 Massenspektrometrie der NKCC2-Immunpräzipitate 52 3.3 Verifikation der Interaktion zwischen ANXA2 und NKCC2 55 3.3.1 Lokalisation von ANXA2 und NKCC2 im TAL und der MD 55 3.3.2 Lokalisation von ANXA2 und P11 in NKCC2-positiven Lipid Rafts 58 3.3.3 Protein-Protein-Interaktion zwischen ANXA2 und NKCC2 60 3.3.3.1 Pulldown Assay 61 3.3.3.2 Peptid Spot Array 62 3.4 Brattleboro Ratten 65 3.4.1 Translokation von ANXA2, P11 und NKCC2 zur apikalen Plasmamembran unter Behandlung mit dDAVP 65 3.4.2 Interaktion zwischen ANXA2 und pNKCC2 unter Behandlung mit dDAVP 69 3.4.3 Assoziation von ANXA2 und NKCC2 mit cholesterinreichen Membranmikrodomänen unter Behandlung mit dDAVP 71 3.4.4 ANXA2 Expression in der äußeren Medulla von Brattleboro Ratten 73 3.5 Funktionelle Analyse der Interaktion zwischen NKCC2 und ANXA2 74 3.5.1 Stimulation von NKCC2 unter Chloridmangel 74 3.5.1.1 Überexpression von ANXA2 und P11 74 3.5.1.2 ANXA2-Knockdown mittels RNA-Interferenz 79 3.5.2 Stimulation von ANXA2 mit Phorbol-12-myristat-13-acetat und Hemmung der Endozytose 82 4 Diskussion 86 4.1 NKCC2 ist ein in spezifischen Lipid Rafts angereichertes Protein 86 4.2 NKCC2 interagiert direkt mit dem Scaffold- Protein ANXA2 in Lipid Rafts 88 4.3 Funktionelle Charakterisierung der Interaktion zwischen NKCC2 und ANXA2 92 4.4 Schlussfolgerung 94 5 Zusammenfassungen 98 5.1 Zusammenfassung 98 5.2 Summary 100 6 Literatur- und Quellenverzeichnis VIII 7 Abbildungsverzeichnis XX 8 Tabellenverzeichnis XXII Selbstständigkeitserklärung XXIII","Der nierenspezifische, furosemidsensitive Natrium-Kalium-Chlorid-Kotransporter Typ 2 (NKCC2) ist für die transepitheliale Natriumchlorid Reabsorption in der dicken aufsteigenden Henle-Schleife (TAL) verantwortlich und somit für die Salz- und Volumenhomöostase des Körpers essentiell. Die Transportaktivität von NKCC2 ist unter anderem von seiner N terminalen Phosphorylierung, seiner apikalen Translokation sowie seiner Assoziation mit Lipid Raft Membranmikrodomänen abhängig. Vasopressin (AVP) stimuliert diese Parameter im Kontext einer gesteigerten Urinkonzentrierung effektiv. Experimentell induzierter hypotonischer Chloridmangel-Stress erzeugt die gleichen Effekte. Dabei wurden zugrundeliegende Mechanismen und interagierende Proteine, die in die Regulation der NKCC2-Aktivität involviert sind, bislang nur wenig untersucht. Um einen besseren Einblick in diese Mechanismen zu erhalten, wurden mittels massenspektrometrischer Analysen potentielle Interaktionspartner von NKCC2 identifiziert. Dazu wurden detergensresistente Membranfraktionen aus einer Sucrose-Dichtegradientenzentrifugation als Ausgangsmaterial für eine NKCC2-Immunpräzipitation eingesetzt. Auf diese Weise wurde, neben anderen Proteinen, das Scaffolding Protein Annexin A2 (ANXA2) als ein neuer Interaktionspartner von NKCC2 in Lipid Rafts identifiziert. In früheren Studien konnte gezeigt werden, dass ANXA2 nicht nur in die Formation von Lipid Rafts involviert ist, sondern auch die Lipid Raft-abhängige Translokation verschiedener Membranproteine, wie Aquaporin 2, vermittelt. Folglich wurde hier die Hypothese, dass ANXA2 eine wesentliche Rolle bei der Rekrutierung von NKCC2 in Lipid Rafts sowie seiner apikalen Translokation einnimmt, aufgestellt. Mit Hilfe morphologischer Methoden wurde eine Kolokalisation von ANXA2 sowie seinem etablierten Komplexpartner P11 (S100A10) mit NKCC2 in den als Rafts identifizierten, apikalen Membrandomänen des TAL gezeigt. Bindungsstudien belegten, dass ANXA2, jedoch nicht P11, direkt mit dem unphosphorylierten N-Terminus von NKCC2 interagiert. Zudem stimulierte allein ANXA2, und nicht P11, die AVP- oder Chloridmangel-Stress-induzierte, apikale Translokation von NKCC2 in einem Tiermodell mit zentralem Diabetes insipidus und in Zellkultur. Die Verminderung der Abundanz von ANXA2 mittels siRNA limitierte die durch Chlorid-Depletion hervorgerufene Akkumulation von NKCC2 in der Plasmamembran, was die Rolle von ANXA2 bei der apikalen Translokation von NKCC2 unterstützt. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass ANXA2 ein essentieller, Lipid Raft-gekoppelter Translokationsfaktor ist, der unter Einsatz etablierter Stimuli direkt die apikale Translokation des Kotransporters NKCC2 vermittelt. Diese Studie liefert somit neue mechanistische Informationen über die Regulation von NKCC2.","The renal furosemide-sensitive Na-K-Cl-cotransporter type 2 (NKCC2) is responsible for transepithelial sodium-chloride reabsorption in the thick ascending limb (TAL) and thus critical to body salt handling and urinary concentration. Transport activity of NKCC2 depends, among other variables, on its N-terminal phosphorylation, its rate of apical trafficking, and on its association with lipid raft membrane microdomains. Vasopressin (AVP) effectively stimulate these parameters in the context of an enhanced urine concentration. Experimentally induced low chloride hypotonic stress has similar effects. Underlying mechanisms and interacting proteins involved in the activation of NKCC2 have so far received only limited attention. To gain better insight into these mechanisms, a mass spectrometric screen was performed to identify potential binding partners of NKCC2 using detergent- resistant membrane fractions from sucrose density gradient centrifugation. Fractions were used for immunoprecipitations with antibody to NKCC2. Among other proteins, the scaffolding protein annexin A2 (ANXA2) was hereby identified as a novel protein interacting with NKCC2 in lipid rafts. ANXA2 is known to stabilize lipid rafts and to mediate lipid raft-dependent trafficking of several membrane proteins such as aquaporin 2. We hypothesized that ANXA2 serves as an essential mediator in the recruitment of NKCC2 into lipid rafts and apical trafficking. With morphological methods we could demonstrate that ANXA2 and its complex-forming partner, P11 (S100A10), are co-distributed with NKCC2 in TAL apical membrane domains identified as rafts. Binding assays revealed direct interaction between ANXA2, but not P11, and the N terminus of NKCC2 in its dephosphorylated state. ANXA2, but not P11, further served to promote apical trafficking of NKCC2 in response to AVP or low chloride hypotonic stress in a rat model for central diabetes insipidus and in cultured cells. RNAi-induced knockdown of ANXA2 revealed that the plasma membrane localization of NKCC2 was limited in absence of ANXA2 during low chloride stimulation, supporting its role in apical trafficking of the cotransporter. In summary, our data have identified ANXA2 as an essential, lipid raft-related trafficking factor which directly promotes the apical trafficking of the cotransporter, NKCC2, in response to established stimuli. This study hereby provides new mechanistic information on the regulation of NKCC2.","XXIII, 100 S.","https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/6153||http://dx.doi.org/10.17169/refubium-10352","urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000096341-1","ger","http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen","NKCC2||ANXA2||apical trafficking","500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::572 Biochemie","Vermittlerrolle von Annexin A2 bei der apikalen Translokation des renalen Natrium-Kalium-Chlorid-Kotransporters Typ 2","Annexin A2 mediates apical trafficking of renal Na-K-2Cl Cotransporter","Dissertation","free","open access","Text||Bild","Biologie, Chemie, Pharmazie","FUDISS_derivate_000000014945","FUDISS_thesis_000000096341"