id,collection,dc.contributor.author,dc.contributor.firstReferee,dc.contributor.furtherReferee,dc.contributor.gender,dc.date.accepted,dc.date.accessioned,dc.date.available,dc.date.issued,dc.description.abstract[de],dc.format.extent,dc.identifier.uri,dc.identifier.urn,dc.language,dc.rights.uri,dc.subject,dc.subject.ddc,dc.title,dc.title.translated[de],dc.type,dcterms.accessRights.dnb,dcterms.accessRights.openaire,dcterms.format[de],refubium.affiliation[de],refubium.mycore.derivateId,refubium.mycore.fudocsId,refubium.note.author "7d7f7083-57af-4c5d-894b-b942a3e645bc","fub188/14","Mastrototaro, Lucia","Univ.-Prof. Dr. Jörg Rudolf Aschenbach","Univ.-Prof. Dr. Heidrun Gehlen||Prof. Dr. Jürgen Vormann","w","2016-10-05","2018-06-07T18:17:07Z","2017-04-10T08:57:55.230Z","2017","It is well known that magnesium deficiency or altered IMH can trigger many pathophysiological conditions, thus a correct functioning of Mg2+ transporters and channels is essential for normal cellular physiology. Mutations in many MRG induce hypomagnesemia which often represents one of the complications of many human ailments. Based on previous data which have characterized SLC41A1 as a plasma membrane Na+/Mg2+ exchanger (4, 5) and as being overexpressed in preeclamptic women (6), the present thesis aimed at a further characterization of SLC41A1 and Mg2+ efflux in some pathophysiological conditions. It further aimed at the molecular characterization of two others MRGs, CNNM2 and SLC41A3, in order to achieve a better understanding of Mg2+ homeostasis and to link the mechanisms of Mg2+ mobilization across the plasma membrane or between intracellular compartments with mitochondrial dysfunction and disease states (e.g.: Parkinson’s disease (PD), diabetes, etc). Proceeding from previous results of Kolisek et al (4, 5), describing SLC41A1 as the major Mg2+ efflux system of the cell, the first study examined the complex-forming ability of SLC41A1 in vivo and identified EBP and other members of the SLC superfamily as potential binding partners. Further experiments evaluated the transport activity of the PD-associated SLC41A1 variant pA350V and defined it as a “gain-of-function” mutation enhancing Mg2+ efflux compared with the wild-type protein. A next question was whether SLC41A1 transport activity could be influenced and regulated by insulin in order to explain the molecular basis of hypomagnesaemia often observed in diabetes patients. The present study shows that insulin reduces the SLC41A1-mediated Mg2+ efflux and, most importantly, it seems to have an effect on intracellular Mg2+ stores, since an earlier onset of Mg2+ release from intracellular stores was observed. In the second part of this thesis, experiments were conducted on stably transfected HEK293 cells overexpressing SLC41A3 in order to uncover the function of SLC41A3 with regard to its ability to transport Mg2+, its mode of Mg2+ transport and its role in cellular Mg2+ homeostasis. To assess the role of SLC41A3 for cellular Mg2+ homeostasis and gain insight into the regulation of transport activity and/or membrane insertion, knowledge about the precise cellular localization and the identification of the binding partners are essential. The present data reveal a specific mitochondrial localization for SLC41A3 and its function as mitochondrial Mg2+ efflux system. They further suggest that the effect of insulin on intracellular Mg2+ stores is most likely mediated via SLC41A3. Given that mitochondria serve as intracellular Mg2+ stores, a mitochondrial dysfunction might affect cellular Mg2+ homeostasis and this could be one reason for intracellular Mg2+ deficiency observed in diseases such as diabetes, PD and hypertension. The last part of the project focused on the physiological characterization of two isoforms of another Mg2+ responsive gene, CNNM2, because a mutation in this gene has been recently associated with severe familial hypomagnesaemia. A previous study showed that CNNM2 is overexpressed in diabetic patients (114) but its expression does not correlate with Mg2+ plasma levels. However, the present study shows an overexpression of CNNM2 in Jurkat and JVM-13 cells after Mg2+ starvation. The protein has an extensive localization in the cells, including the mitochondrial membrane, and its putative interactors include proteins involved in the regulation of mitochondrial homeostasis (mitophagy, clearance of ROS). A further question was whether the two isoforms (I1 and I2) of CNNM2 are able to transport Mg2+, but the data presented herein clearly indicate that CNNM2 transports Mg2+ neither in electrogenic nor in electroneutral mode in transgenic HEK293 cells overexpressing I1 or I2. This strongly suggests that CNNM2 might represent the first magnesium homeostatic factor without being a Mg2+ transporter per se. Instead CNNM2 can be postulated to sense the changes in extracellular and/or intracellular Mg2+ concentration and consequently activates other proteins responsible for Mg2+ mobilization in the cell. From these data a role of CNNM2 in intracellular Mg2+ homeostasis can be assessed and it can be speculated that the two SLC41 proteins act cooperatively with CNNM2-mediated Mg2+ sensing in controlling the cellular magnesium homeostasis.||Es ist allgemein anerkannt, dass ein Magnesiummangel oder eine veränderte intrazelluläre Mg2+-Homöostase (IMH) viele pathophysiologische Zustände auslösen kann. Daher ist die einwandfreie Funktion von Mg2+-Transportern und Mg2+-Kanälen für physiologische Zellfunktionen essenziell. Mutationen in Mg2+-regulierten Genen (MRG) können eine Hypomagnesiämie induzieren, die bei vielen Erkrankungen zu Komplikationen führen kann. Basierend auf früheren Daten, die SLC41A1 als einen Na+/Mg2+-Austauscher in der Plasmamembran charakterisiert haben und als Gen, das bei Frauen mit Präeklampsie überexprimiert ist, war das Ziel dieser Arbeit eine weitere Charakterisierung von SLC41A1 und des durch dieses Protein vermittelten Mg2+-Effluxes unter pathophysiologischen Zuständen. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die funktionelle Charakterisierung der MRGs CNNM2 und SLC41A3 im Hinblick auf ihre Bedeutung für die intrazelluläre Mg2+-Homöostase. Insbesondere sollten mögliche Beziehungen zwischen den Mechanismen des Mg2+-Transportes über die Plasmamembran bzw. zwischen intrazellulären Kompartimenten mit mitochondrialer Dysfunktion und bestimmten Krankheitszuständen (z.B.: Morbus Parkinson, Diabetes, etc.) aufgedeckt werden. Ausgehend von früheren Ergebnissen von Kolisek et al., die SLC41A1 als den Hauptmechanismus für den Mg2+-Efflux aus der Zelle beschrieben hatten, untersuchte der erste Teil der Studie die Fähigkeit von SLC41A1 Proteinkomplexe zu bilden. Emopamil binding protein (EBP) und andere Vertreter der SLC Superfamilie wurden als potentielle Bindungspartner identifiziert. In weiteren Experimenten wurde die Transportaktivität der mit Morbus Parkinson assoziierten SLC41A1 Variante pA350V evaluiert und gezeigt, dass es sich um eine „gain-offunction“ Mutation handelt, die im Vergleich zum Wildtyp-Protein einen erhöhten Mg2+-Efflux aus der Zelle bedingt. Anschließend wurde die Fragestellung untersucht, ob die Transportaktivität von SLC41A1 durch Insulin beeinflusst werden kann, da bei Diabetes-Patienten oft eine Hypomagnesiämie beobachtet wird. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass Insulin den SLC41A1-vermittelten Mg2+-Efflux reduziert und offensichtlich einen Effekt auf intrazelluläre Mg2+-Speicher hat, da ein früheres Einsetzen der Mg2+-Freisetzung aus intrazellulären Speichern beobachtet wurde. Im zweiten Teil der Arbeit wurde eine stabil transfizierte, SLC41A3-überexprimierende HEK293 Zelllinie verwendet, um die Fähigkeit dieses Proteins, Mg2+ zu transportieren, näher zu untersuchen und seine Rolle in der zelluläre Mg2+-Homöostase zu charakterisieren. Um die Regulation der Transportaktivität und die Rolle von SLC41A3 in der zelluläre Mg2+-Homöostase zu verstehen, war es notwendig die zelluläre Lokalisation und etwaige Bindungspartner zu identifizieren. Die vorliegenden Daten zeigen eine spezifische Lokalisation in den Mitochondrien und eine Funktion als mitochondriales Mg2+-Efflux System. Diese Ergebnisse legen nahe, dass der beobachtete Effekt von Insulin auf intrazelluläre Mg2+-Speicher wahrscheinlich durch SLC41A3 vermittelt wird. Vorausgesetzt, dass Mitochondrien als intrazelluläre Mg2+-Speicher fungieren, kann eine mitochondriale Dysfunktion auch die zelluläre Mg2+-Homöostase beeinflussen und ein Grund für die bei Krankheiten wie Diabetes, Morbus Parkinson oder Bluthochdruck beobachtete intrazelluläre Mg2+-Defizienz sein. Der letzte Teil der Arbeit konzentrierte sich auf die physiologische Charakterisierung zweier Isoformen des Mg2+-regulierten Gens CNNM2 (I1 und I2). Mutationen in diesem Gen sind mit schwerer, familiärer Hypomagnesiämie assoziiert. Eine vorangegangene Studie hatte gezeigt, dass CNNM2 in Diabetes-Patienten überexprimiert war, die Expression aber nicht mit den Mg2+- Spiegel im Plasma korrelierte. In der vorliegenden Arbeit konnte aber eine Überexpression von CNNM2 in Jurkat und JVM-13 Zellen nach Mg2+-Depletion gezeigt werden. Das Protein war in der Zelle weit verbreitet, auch in Mitochondrien, und seine potentiellen Interaktionspartner umfassen Proteine, die an der Regulation der Mitochondrien-Homöostase (Mitophagie, Beseitigung reaktiver Sauerstoffspezies) beteiligt sind. Es wurde auch untersucht, ob die beiden CNNM2-Isoformen in der Lage sind, Mg2+ zu transportieren. Die hier präsentierten Daten zeigen eindeutig, dass in HEK293 Zellen, die CNNM2 überexprimieren, das Protein weder in elektrogener noch in elektroneutraler Weise Mg2+ transportiert. Diese Ergebnisse legen nahe, dass CNNM2 der erste Mg2+-homöostatische Faktor ist, der selbst keine Transportaktivität besitzt. Das Protein scheint die extrazelluläre und/oder intrazelluläre Mg2+-Konzentration zu messen und darauffolgend andere Proteine, die für die Mg2+-Mobilisierung in der Zelle verantwortlich sind, zu aktivieren. Diese Daten charakterisieren CNNM2 als zentralen Faktor für die intrazelluläre Mg2+-Homöostase und es kann angenommen werden, dass die beiden SLC41 Proteine kooperativ mit dem Mg2+-Sensor CNNM2 die zelluläre Mg2+-Homöostase regulieren.","IV, 123 Seiten","https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/4857||http://dx.doi.org/10.17169/refubium-9056","urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000104481-9","eng","http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen","magnesium||SLC41A1||SLC41A3||CNNM2||neurodegeneration||Parkinson’s disease||insulin||intracellular magnesium homeostasis","600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften::630 Landwirtschaft::630 Landwirtschaft und verwandte Bereiche","SLC41A1, SLC41A3 and CNNM2: Magnesium responsive genes with potential involvement in human ailments","SLC41A1, SLC41A3 und CNNM2: Magnesium-responsive Genes mit potentieller Beteiligung an humanen Krankheiten","Dissertation","free","open access","Text","Veterinärmedizin","FUDISS_derivate_000000021270","FUDISS_thesis_000000104481","Mensch und Buch Verlag"