id,collection,dc.contributor.author,dc.contributor.contact,dc.contributor.firstReferee,dc.contributor.furtherReferee,dc.contributor.gender,dc.date.accepted,dc.date.accessioned,dc.date.available,dc.date.issued,dc.description.abstract[de],dc.description.abstract[en],dc.format.extent,dc.identifier.uri,dc.identifier.urn,dc.language,dc.rights.uri,dc.subject,dc.subject.ddc,dc.title,dc.title.translated[en],dc.type,dcterms.accessRights.dnb,dcterms.accessRights.openaire,dcterms.format[de],refubium.affiliation[de],refubium.mycore.derivateId,refubium.mycore.fudocsId "175ce538-df43-4f04-a645-b0197c516034","fub188/14","Seidel, Gunnar","gunnarseidel@mail.de","Prof. Dr. Hans Lehrach","Prof. Dr. Rupert Mutzel","m","2017-07-13","2018-06-07T17:12:13Z","2017-09-01T09:23:03.353Z","2017","Spinocerebelläre Ataxie 2 (SCA2) ist eine autosomal-dominante hereditäre, neurodegenerative und mit PolyQ-Repeat-Expansionen im Ataxin-2-Protein assoziierte PolyQ-Erkrankung, die von progressivem Bewegungskoordinations- Kontrollverlust sowie Kleinhirn- und Rückenmarks-Atrophie gekennzeichnet ist. Ferner gibt es Hinweise darauf, dass zwei proteolytisch prozessierte Ataxin-2-Spaltprodukte (N- und C-Terminus) bei der SCA2-Pathogenese eine Rolle spielen könnten, die jedoch kaum erforscht sind. Deshalb wurden hier entsprechende, rekombinante Spaltprodukte mit Hilfe des S. cerevisiae- Modellsystem untersucht, wobei Wachstumstests sowie mikroskopische Studien durchgeführt wurden, um zu erfahren, ob die Spaltprodukte zytotoxisch wirken können und um ihre Fokibildung und subzelluläre Lokalisation zu analysieren. Diese Experimente zeigten, dass der Ataxin-2-C-Terminus, nicht jedoch dessen N-Terminus, in S. cerevisiae zytotoxische Effekte vermittelt, und es konnte zudem festgestellt werden, dass der C-Terminus stärker als der N-Terminus zur Bildung mikroskopisch sichtbarer Foki neigte. Dies führte zur Hypothese, dass die Foki des C-Terminus für dessen Zytotoxizität in Hefe verantwortlich gewesen sein könnten, welche auch durch die hier gemachte Beobachtung gestützt wird, dass C-Terminus-Fokibildung und -Zytotoxizität beide durch die Deletionen der Hefegene POP2 oder CCR4 signifikant verstärkt wurden. Interessanterweise zeigten ähnliche hier durchgeführte Untersuchungen zu Zytotoxizität und Bildung zellschädigender Aggregate des mit Ataxin-2 verknüpften TDP-43-Proteins, dass auch diese durch POP2 oder CCR4-Deletion begünstigt wurden. Ferner ergaben diesbezüglich durchgeführte Sequenzalignment, dass eine 85 Aminosäure lange Ataxin-2-Region signifikante Ähnlichkeit mit einem großen Teil der prionartigen Domäne von TDP-43 besitzt. Insgesamt ließ dies vermuten, dass die Ataxin-2-C-Terminus-Foki ähnlich den TDP-43-Aggregaten in Hefe entstehen, und dass für ihre Bildung und ihre mutmaßlich zytotoxischen Eigenschaften prionartige Mechanismen bedeutsam sein könnten. Da Ataxin-2 und sein Hefe-Ortholog PBP1 zudem als Stress-Granula (SG)-Komponenten bekannt sind, wurde hier auch geprüft, ob es sich bei den beobachteten C Terminus-Foki um Hefe-SG gehandelt haben könnte, was jedoch widerlegt wurde. Außerdem wurde dabei festgestellt, dass die Bildung herkömmlicher Hefe-SG durch C-Terminus-Expression gehemmt wird. Folge- Experimente zu Spaltprodukt-Fokibildung und -Lokalisation in HeLa-Zellen wiesen ferner darauf hin, dass auch im humanen System v.a. der Ataxin-2-C-Terminus zellschädigende Wirkung haben könnte. Unabhängig davon zeigte sich hierbei auch, dass der Ataxin-2-N-Terminus anders als Ataxin-2 oder sein C-Terminus, teilweise im Nukleus der Zellen lokalisiert war, weshalb die Ataxin-2-Sequenz anschließend hinsichtlich unkonventioneller Kernimport- Sequenzmotive untersucht wurde, wobei ein bisher unbekanntes, mutmaßliches Kernimportsignal im Ataxin-2-N-Terminus identifiziert wurde. Ferner konnte gezeigt werden, dass eine pathogene N-Terminus-Variante mit PolyQ-Expansion (79 Q-Repeats) häufiger im Zytoplasma lokalisiert war und dort zudem stärker zur Fokibildung neigte als eine nicht pathogene N-Terminus-Isoform (22 Q-Repeats), was für die SCA2-Pathogenese bedeutsam sein könnte. Abschließende Proteomstudien mit PBP1-Hefe-Deletionsstämmen ließen ferner erkennen, dass PBP1 bestimmte Proteine der zellulären Hitze-Stressantwort (v. a. Chaperone) positiv reguliert. Insgesamt hatte PBP1 jedoch hauptsächlich negativen regulatorischen Einfluss auf das Hefe-Proteom, wobei Komponenten katalytischer Komplexe (v.a. transkriptionsrelevante Komplexe und proteinmodifizierende Transferasen des ER und Golgi-Apparats) unter den negativ regulierten Proteinen spezifisch angereichert waren. Zusammengefasst konnte PBP1 somit als Regulator der Gentranskription, kotranslationaler Proteinmodifikationen und der Protein-Qualitätskontrolle in S. cerevisiae identifiziert werden.","Spinocerebellar Ataxia 2 (SCA2) is an autosomal dominant hereditary, neurodegenerative PolyQ-disease, associated with PolyQ-expansions in the Ataxin-2 protein, which is mainly characterized by a progressive loss of movement coordination control as well as atrophy of the cerebellum and the spine. Furthermore, there are hints that two proteolytically processed Ataxin-2 cleavage products (N- and C-terminus) might act in the pathogenesis of SCA2. But little is known about them. Therefore, respective recombinant cleavage products were analyzed here employing the S. cerevisiae model system. These analyses included growth assays and microscopic studies that aimed at finding out whether the cleavage products have cytotoxic activity and to analyze their foci formation and subcellular localization. These experiments showed that the Ataxin-2-C-terminus, but not its N-terminus, mediated cytotoxicity in S. cerevisiae, and it could further be noticed that the C-terminus was also more prone to formation of microscopically visible foci than the N-terminus. This led to the hypothesis that the foci of the C-terminus might have been responsible for its cytotoxic effects in the yeast cells, which was further supported by the observation that C-terminus foci formation and cytotoxicity were both significantly enhanced by the deletions of the yeast genes POP2 or CCR4. Interestingly, alike experiments conducted here regarding the cytotoxicity and formation of harmful aggregates of the Ataxin-2-related protein TDP-43 showed that both were augmented by the deletions of POP2 or CCR4, too. Furthermore, sequence alignments performed as a consequence of these results revealed that an 85 amino acid containing Ataxin-2 region has significant overlap with a huge part of the prion-like domain of TDP-43. Taken together these results suggest that the foci of the Ataxin-2-C-terminus might have been formed and mediated their putatively cytotoxic effects similarly to the TDP-43 aggregates, possibly involving prion-like mechanisms. Since Ataxin-2 and its yeast ortholog PBP1 are known stress granule (SG) components, it was also tested whether the C-terminus foci could have been SG, which was disproved here. Moreover, these analyses also showed that the formation of conventional yeast SG is inhibited by Ataxin-2-C-terminus expression. Additional experiments regarding foci formation and localization of the cleavage products in HeLa-cells then further pointed towards a possible cell death enhancing effect of the Ataxin-2-C-terminus in human cells. However, it was also shown in these analyses that the Ataxin-2-N-terminus could be partly localized in the cells nuclei (in contrast to full-length Ataxin-2 or its C-terminus), which motivated a search for unconventional nuclear localization signals in the Ataxin-2 sequence that revealed a hitherto unknown, putative nuclear import sequence in the Ataxin-2 N-terminal region. Moreover, it was also observed that a pathogenic N-terminus variant (79 Q-repeats) was more prone to cytoplasmic localization as well as accumulation than the respective non- pathogenic N-terminus (22 Q-repeats), which might be relevant to SCA2-pathogenesis. Finally, a proteome study using PBP1 deletion strains further revealed that PBP1 positively regulates certain proteins of the cellular heat stress response (mainly chaperones). However, PBP1 in general was found to exert mostly negative regulatory effects on the yeast proteome, with specific enrichments of components of catalytic complexes (primarily transcription-related complexes and protein-modifying transferases of the ER and the Golgi apparatus) in the fraction of negatively regulated proteins. In summary, this means that PBP1 could be identified here as a regulator of gene transcription, co-translational protein modification processes and the protein quality control system in S. cerevisiae.","205 Seiten","https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/3524||http://dx.doi.org/10.17169/refubium-7724","urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000105328-8","ger","http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen","SCA2||Ataxin-2||cleavage||yeast||HeLa||PBP1 function||POP2||CCR4||TDP-43||proteome||NLS||toxicity||localization||prion-like","500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie","Zellbiologische Untersuchungen physiologischer Ataxin-2-Spaltprodukte und Studien zur Funktion des Ataxin-2-Orthologs PBP1 im S. cerevisiae-Modellsystem","Cell biological examinations of physiological Ataxin-2 cleavage products and studies on the function of the Ataxin-2 ortholog PBP1 in an S. cerevisiae model system","Dissertation","free","open access","Text","Biologie, Chemie, Pharmazie","FUDISS_derivate_000000022184","FUDISS_thesis_000000105328"