id,collection,dc.contributor.author,dc.contributor.firstReferee,dc.contributor.furtherReferee,dc.contributor.gender,dc.date.accepted,dc.date.accessioned,dc.date.available,dc.date.issued,dc.description.abstract[de],dc.description.abstract[en],dc.format.extent,dc.identifier.uri,dc.identifier.urn,dc.language,dc.rights.uri,dc.subject.ddc,dc.subject[en],dc.title,dc.type,dcterms.accessRights.dnb,dcterms.accessRights.openaire,dcterms.accessRights.proquest,dcterms.format,refubium.affiliation,refubium.note.author[en] "0eaf9c00-5db0-4fda-8a61-a749adac4c70","fub188/14","Christen, Friederike","Damm, Frederik","Hiesinger, Peter Robin","female","2021-12-15","2022-01-27T15:14:42Z","2022-01-27T15:14:42Z","2022","Um die Entwicklung von Krankheiten aufzudecken und etwaige zielgerichtete Behandlungsstrategien zu entwickeln, ist es essenziell den funktionellen Einfluss bestimmter Genmutationen zu untersuchen. Mutationen in epigenetischen Regulatoren wie DNMT3A, TET2 und ASXL1 (auch DTA-Mutationen genannt) wurden sowohl in Patienten mit akuter myeloischer Leukämie als auch in Patienten ohne hämatologische Erkrankung gefunden. Diese Mutationen führen zu einem Vorteil bestimmter Zellklone, die daraufhin expandieren. DTA-Mutationen werden auch als prä-leukämische Mutationen bezeichnet, die vor dem Ausbruch der Leukämie bereits in Stamm- und Vorläuferzellen vorkommen und ein erhöhtes Risiko für das Auftreten weiterer Mutationen bedingen. Zusätzliche Mutationen in einem prä-leukämischen Klon können wiederum zur malignen Transformation des Zellklons führen. Des Weiteren können Zellen mit prä-leukämischen Mutationen resistent gegen Chemotherapie sein und somit das Risiko eines Rezidivs erhöhen. In dieser Arbeit habe ich den Einfluss von Mutationen in DNMT3A, TET2 und ASXL1 auf humane hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen untersucht, sowie die Rolle von prä-leukämischen Mutationen in Patienten mit AML t(8;21) erforscht. Mit Hilfe von CRISPR/Cas9 wurden spezifische Mutationen in CD34-positiven Vorläuferzellen eingeführt, die frisch aus Nabelschnurblut isoliert wurden. Die Cas9-Nuklease wurde zusammen mit in vitro-transkribierter sgRNA in Form von Ribonukleoproteinen in die Zellen gebracht. In Exon 13 von ASXL1 wurden Insertionen und Deletionen in mindestens 40% der Zellen generiert und in Exon 6 des Gens TET2 konnten in mehr als 90% der Zellen Insertionen und Deletionen entdeckt werden. Die spezifische Mutation DNMT3A R882H wurde in bis zu 50% der transfizierten Zellen eingeführt. Die erfolgreich mutierten Zellen wurden anschließend in in vitro-Experimenten untersucht in Hinsicht auf Veränderungen im Phänotyp, der Fähigkeit zur Selbsterneuerung, Differenzierungsfähigkeit und der Fähigkeit sich in Langzeitkulturen zu vermehren. Die klonale Zusammensetzung, sowie die Expansion bestimmter Zellklone wurden mit Hilfe von Deep Sequencing und anschließender Analyse der generierten Insertionen und Deletionen untersucht. Patienten mit AML t(8;21) wurden auf prä-leukämische Mutationen untersucht, indem DNA vom Diagnosezeitpunkt via Next-Generation Sequenzierung analysiert wurde. Kodierende Regionen von 66 Genen, die wiederholt in malignen hämatologischen Erkrankungen auftreten, wurden in die Analyse eingeschlossen. Von 56 Patienten wurden DNA-Proben vom Zeitpunkt der klinischen Remission erneut auf die bereits identifizierten Mutationen untersucht. In dieser Arbeit konnte ich zeigen, dass Mutationen in DNMT3A, TET2 und ASXL1 unterschiedliche Effekte auf hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen haben. Mutationen in ASXL1 hatten den mildesten Effekt. Weder Unterschiede in der Expression von Differenzierungsmarkern noch erhöhte Replatierungsfähigkeit in Vergleich zu Wildtypzellen wurden beobachtet. Des Weiteren zeigten die Zellen kein vermehrtes Wachstum in der Langzeitkultur. Sie waren jedoch in der Lage Kolonien nach der Langzeitkultur zu bilden, was bedeuten könnte, dass diese Zellen trotz des unveränderten Proliferationsverhaltens einen Vorteil gegenüber Wildtypzellen haben und somit in der Lage sind die Langzeitkultur zu überdauern. Zellen mit DNMT3A Mutationen exprimierten den Vorläuferzellmarker CD34 länger als Kontrollzellen. Mutationen in TET2 führten zu einer verspäteten Expression von myeloischen Differenzierungsmarkern und einem erhöhten Selbsterneuerungspotential von Vorläuferzellen. Sowohl in Zellen mit DNMT3A- als auch mit TET2-Mutationen konnte ich die Expansion bestimmter mutierter Zellklone nachweisen. Die Proben mit eingeführten Mutationen in TET2 hatten jedoch eine größere Anzahl verschiedener Insertionen und Deletionen als Proben mit DNMT3A-Veränderungen. Die Daten dieser Arbeit zeigen, dass Mutationen in DNMT3A dazu führen, dass primitive Zellklone einen evolutionären Vorteil erhalten, wohingegen reifere Vorläuferzellen von Mutationen in TET2 profitieren. Mutationen in ASXL1 führen möglicherwiese nur in Anwesenheit weiterer genetischer oder zellulärer Veränderungen zu klonaler Expansion. In Patienten mit AML t(8;21) treten Mutationen in DNMT3A und TET2 wahrscheinlich früher auf als andere Mutationen und kommen möglicherweise in Vorläuferzellen vor, bevor sich die eigentliche Erkrankung entwickelt. Mutationen in ASXL1 scheinen weder frühe noch späte Ereignisse zu sein, sondern treten irgendwann dazwischen auf. Sie kooperieren möglicherweise mit anderen Mutationen, um Zellen zu transformieren. In dieser Arbeit konnte ich zeigen, dass DTA-Mutationen die Fitness von bestimmten Stamm- und Vorläuferzellen im menschlichen Stammzellkompartiment erhöhen und so zu einer Expansion der mutierten Zellklone führen. Die Ergebnisse dieser Arbeit bestätigen, dass die Untersuchung und Beobachtung prä-leukämischer Klone dazu beitragen könnte, ein Rezidiv oder sogar die Entstehung schwerer hämatologische Erkrankungen zu verhindern.","Dissecting functional consequences of gene mutations contributes to understanding disease development and identifying potential treatment strategies. Mutations in epigenetic regulators (especially in DNMT3A, TET2, and ASXL1, termed DTA mutations) have been identified in acute myeloid leukemia patients, as well as individuals without history of hematologic malignancies. Mutations in these genes are hypothesized to confer a clone a competitive advantage, leading to preferential expansion of this specific clone. DTA mutations are proposed to be preleukemic events that are acquired before leukemia onset and are thought to elevate the risk for acquisition of additional mutations that in turn drive malignant transformation. Clones harboring these mutations are able to survive chemotherapy, potentially increasing the risk for disease recurrence. In this thesis, I investigated the impact of DTA mutations in the human hematopoietic stem and progenitor cell compartment, as well as the role of preleukemic events in patients with AML t(8;21). Using CRISPR/Cas9, site-specific mutations were introduced in CD34+ progenitor cells freshly isolated from umbilical cord blood samples. By delivering Cas9 nuclease together with an in vitro transcribed sgRNA as ribonucleoprotein, I was able to achieve editing efficiencies ranging from 40% for the sgRNA targeting exon 13 of ASXL1 to over 90% for the sgRNA targeting exon 6 of TET2. A known hotspot mutation in DNMT3A R882H was introduced with an efficiency of up to 50% in the cell bulk. After successful genetic modification, cells were subjected to in vitro assays to assess phenotype, self-renewal properties, differentiation capacities, and long-term culture-initiating potential. Clonal composition and expansion were assessed via deep sequencing and subsequent analysis of introduced specific insertions and deletions. To investigate the role and importance of preleukemic mutations in AML leukemogenesis, a comprehensive genetic in-depth characterization of AML t(8;21) was performed. To this aim, DNA from the time of diagnosis was analyzed via next generation sequencing with a targeted gene panel including exons and coding regions of 66 genes recurrently mutated in hematologic malignancies. From 56 patients, samples from clinical remission were analyzed for the previously identified mutations by targeted re-sequencing of amplicons spanning the target region. In this thesis, I was able to demonstrate that mutations in DNMT3A, TET2, and ASXL1 influence the behavior of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) in a gene-specific fashion. Mutations in ASXL1 had only little effect on HSPCs with no observed changes in expression of differentiation markers after culture for three weeks and no enhanced proliferation in long-term culture. The only hint that ASXL1 mutations have an impact on the fitness of HSPCs was increased colony forming ability after long-term culture, meaning that although progenitor cells did not proliferate during the long-term culture period, they were able to sustain and generate colonies later. DNMT3A mutations led to a longer retention of CD34 marker expression in differentiation culture experiments, but not enhanced serial replating capacity. TET2-mutated cells, in contrast, showed delayed myeloid marker expression in short-term culture and increased self-renewal of committed progenitor cells. Both, DNMT3A and TET2 mutations led to clonal expansion of distinct cell clones during long-term culture with a competitive advantage over wild type cells. The clonal composition of TET2- and DNMT3A-mutated samples differed, with TET2mut samples being more diverse. Collectively my data indicate that DNMT3A mutations preferentially influence primitive HSC clones, whereas TET2 mutations enhance the fitness of committed progenitor cell clones. ASXL1 mutations might need additional events to drive clonal expansion. Analysis of patient samples revealed that mutations in DNMT3A and TET2 are early events in AML t(8;21) and potentially acquired before the onset of the disease. ASXL1 mutations are neither early nor late events in these patients but are potentially cooperating events in leukemia transformation. In this thesis, I was able to demonstrate that DTA mutations enhance the fitness of distinct human hematopoietic stem or progenitor cell clones, in terms of self-renewal and proliferative capacity, leading to clonal expansion. The results obtained here highlight the importance of monitoring specific preleukemic events to prevent disease recurrence as well as development of severe hematologic conditions.","xiv, 112, XXII Seiten","https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/33304||http://dx.doi.org/10.17169/refubium-33025","urn:nbn:de:kobv:188-refubium-33304-7","eng","http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen","500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::570 Biowissenschaften; Biologie","hematopoietic stem and progenitor cells||clonal hematopoiesis||preleukemic mutations||acute myeloid leukemia","Functional Impact of Preleukemic Mutations on the Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cell Compartment","Dissertation","free","open access","accept","Text","Biologie, Chemie, Pharmazie","Parts of this dissertation were already published elsewhere: (1) Christen, F., Hoyer, K., Yoshida, K. et al. Genomic landscape and clonal evolution of acute myeloid leukemia with t(8;21): an international study on 331 patients. Blood 2019; 133 (10): 1140–1151. doi: https://doi.org/10.1182/blood-2018-05-852822 and (2) Christen, F., Hablesreiter, R., Hoyer, K. et al. Modeling clonal hematopoiesis in umbilical cord blood cells by CRISPR/Cas9. Leukemia (2021). https://doi.org/10.1038/s41375-021-01469-x"