id,collection,dc.contributor.author,dc.contributor.firstReferee,dc.contributor.furtherReferee,dc.contributor.gender,dc.date.accepted,dc.date.accessioned,dc.date.available,dc.date.issued,dc.description.abstract[de],dc.format.extent,dc.identifier.uri,dc.identifier.urn,dc.language,dc.rights.uri,dc.subject,dc.subject.ddc,dc.title,dc.title.subtitle,dc.title.translated[de],dc.title.translatedsubtitle[de],dc.type,dcterms.accessRights.dnb,dcterms.accessRights.openaire,dcterms.format[de],refubium.affiliation[de],refubium.mycore.derivateId,refubium.mycore.fudocsId "328da5ea-109c-4638-8656-20bbc55880cb","fub188/14","Voreck, Anja Marion","Prof. Dr. Hartmut Oschkinat","Prof. Dr. Bernd Reif (Technische Universität München)","w","2014-11-24","2018-06-07T17:03:10Z","2015-01-23T08:25:04.213Z","2015","ATP-binding cassette (ABC) transporters are ubiquitous multi-subunit transmembrane (TM) protein complexes. They play vital roles in physiological processes like nutrient uptake in prokaryotes, lipid metabolism and extrusion of toxic compounds. ABC transporters hamper chemotherapy of cancer and treatment of infectious diseases by actively removing drugs from the cytoplasm. Both, ABC import and export systems require the energy obtained from ATP hydrolysis within their nucleotide binding 'domains' (NBDs) to translocate their substrates across lipid bilayers. In contrast to exporters, ABC importers rely on an additional substrate binding protein (SBP) that captures substrate molecules and delivers them to the transmembrane domains (TMDs) of the transporter. X-ray structures of the E. coli maltose importer in different nucleotide-bound states and in a lipid-free environment have been published. On this basis, a transport cycle was proposed that includes an ‘Alternating Access’ mechanism describing the structural changes in ABC transporters upon substrate translocation. However, despite the many similarities, functional differences between the two transporter classes exist and the details of the translocation mechanism in the native lipid environment are far from understood. In the frame of this thesis, structurally distinct states of the amino acid importer ArtMP-J from Geobacillus stearothermophilus were investigated in lipid bilayers using ADP and the non-hydrolyzable ATP- analog AMPPCP to capture the post-hydrolysis and transition states, respectively. Magic angle spinning (MAS) solid-state NMR (ssNMR) was used as the primary tool to characterize lipid-embedded ArtMP. The occurrence of non- covalently linked subunits (ArtM and ArtP, two of each) in ArtMP-J facilitated their individual labeling within the functional complex. As a major part of this thesis the protocols for labeling of ArtP or ArtM in ArtMP were improved to yield preparations suitable for subsequent spectroscopic investigations. Heterologous expression of ArtM and its enrichment with NMR-active isotopes had to be optimized and highly cost-efficient 2H,13C,15N labeling of the TMD was achieved by adapting the ‘condensed Single Protein Production’ protocol. The thermodynamic parameters of nucleotide binding to ArtP and ArtMP were analyzed by isothermal titration calorimetry (ITC). Experiments with the soluble NBD ArtP alone yielded comparable affinities for ATP and ADP (6 µM), while the non-hydrolyzable analogs AMPPNP and AMPPCP bound by factors of 8 and 45 weaker. The detergent-solubilized ArtMP complex showed strongest affinity for ADP (13 µM) while both AMPPNP and AMPPCP bound with KDs of around 70 µM. Interestingly, the interaction of ArtMP and ADP was endothermic, while all other nucleotides bound in an exothermic reaction. In the next step, structural effects of nucleotide-binding to ArtP were investigated by solution NMR. Binding of ATP and ADP led to identical chemical shift changes in agreement with the comparable KDs, suggesting very similar structural properties of the complexes. 1H-detected ssNMR spectroscopy was then applied to further investigate nucleotide-dependent changes of the functional ArtMP complex in lipid bilayers. As a requirement for this study, initial assignments for the subunit ArtP were obtained from combining the available solution NMR assignment with data from 1H-detected 3D ssNMR experiments applied to the lipid-embedded transporter. The amide cross peaks of the assigned residues were used as sensitive monitors for ADP- and AMPPCP-induced conformational changes in ArtP within the ArtMP complex. Many of the observed chemical shift changes in the spectra of the full complex resembled the observations obtained by solution NMR on ArtP alone. Remarkably, the presence of nucleotide also affected signals from regions distant to the nucleotide binding site. Integrating data from both solution and ssNMR with a simple homology model of ArtMP enabled the proposal of a potential route for transmission of structural changes induced by nucleotide-binding towards the ArtP and ArtM interface. Towards achieving full resonance assignments of ArtMP, 1H detected experiments at 40 kHz MAS were performed. Several preparations were investigated, including samples containing either the NBD (ArtP) or the TMD (ArtM) in a triple-labeled form while the other subunit remained at natural abundance. In the respective basic triple-resonance experiments (hCaNH and hCoNH) 80 % of the expected peaks for ArtP were observed. Completion of this data set by experiments yielding correlations across amide bonds will soon enable full structural characterization of the transporter. As part of a wider perspective, the produced samples were also employed in projects aiming at the advancement of NMR technology, for example by including deuterium into quadruple-resonance NMR experiments. By combining deuterium excitation with proton detection additional cross peaks were obtained in 3D spectra as compared to triple-resonance experiments including only manipulation of proton, carbon and nitrogen spins. This implicated that ArtM contains solvent-shielded regions with insufficient reincorporation of protons at labile sites. These regions are challenging to investigate using pulse sequences that start with an initial 1H to 13C cross polarization (CP) transfer. For integral membrane proteins that cannot be fully un- and refolded to guarantee sufficient proton back-exchange, this new method offers a valuable alternative for structural investigations (published in Akbey et al., 2014). This study exemplifies how 1H-detected fast spinning ssNMR can be applied to complex multi-component systems for investigation of biological function. It represents one of the first applications of this technique for detection of ligand binding to a transmembrane protein in its native lipid environment, by monitoring the conformational changes in ArtMP upon interaction with different nucleotides.||ATP-binding cassette (ABC)- Transporter sind ubiquitäre Transmembranproteine, die sich aus mehreren Komponenten zusammensetzen. Sie spielen entscheidende Rollen in physiologischen Prozessen wie der Nährstoffaufnahme in Prokaryoten, im Lipid-Metabolismus und der Ausschleusung toxischer Substanzen. ABC- Transporter erschweren die Chemotherapie von Krebs und die Behandlung infektiöser Krankheiten, indem sie pharmakologisch aktive Moleküle aktiv aus dem Zytoplasma entfernen. Sowohl ABC-Import- als auch -Export-Systeme nutzen die Energie der Hydrolyse von ATP zwischen ihren Nukleotidbindedomänen (NBDs) zur Translokation ihrer Substrate über Lipiddoppelschichten. Im Gegensatz zu Exportern, sind ABC-Importer auf ein zusätzliches Substratbindeprotein (SBP) angewiesen, welches Substratmoleküle einfängt und den Transmembrandomänen zuführt. Röntgenkristallstrukturen des Maltose-Importers aus E. coli in unterschiedlichen nukleotid-gebundenen Zuständen und in lipid-freier Umgebung wurden bereits publiziert. Auf dieser Basis wurde ein Transportzyklus postuliert, der einen sogenannten „Alternating Access“-Mechanismus für die Beschreibung der strukturellen Änderungen in ABC-Transportern während der Substratranslokation zugrunde legt. Trotz der vielen Gemeinsamkeiten existieren funktionale Unterschiede zwischen den beiden Transporter-Klassen und Details zum Translokationsmechanismus in nativer Lipidumgebung sind kaum verstanden. Im Rahmen dieser Arbeit, wurden verschiedene strukturelle Zustände des Aminosäure-Importers ArtMP-J aus Geobacillus stearothermophilus in Lipiddoppelschichten untersucht, indem ADP sowie das nicht-hydrolysierbare ATP-Analogon AMPPCP für die Präparation des post-hydrolytischen sowie des Übergangszustandes verwendet wurden. Magic angle spinning (MAS)-Festkörper- NMR-Spektroskopie wurde als primäre Methode zur Charakterisierung des lipid- umschlossenen ArtMP verwendet. Der Aufbau aus nicht-kovalent gebundenen Untereinheiten (jeweils zweimal ArtM und ArtP) in ArtMP-J erleichtert deren individuelle Markierung mit NMR-aktiven Isotopen (Labeling) innerhalb des funktionalen Komplexes. Ein Großteil der vorliegenden Arbeit bestand in der Verbesserung von Labeling-Protokollen für ArtP oder ArtM in ArtMP sowie der spektroskopischen Untersuchung der präparierten Komplexe. Dazu mussten Protokolle zur heterologen Expression des isolierten ArtM sowie dessen Anreicherung mit NMR-aktiven Isotopen optimiert werden. Eine höchst kosteneffiziente Markierung der TMD mit den Isotopen 2H,13C und 15N konnte durch Adaptierung der ‘condensed Single Protein Production‘-Methode erzielt werden. Die thermodynamischen Parameter der Nucleotidbinding an ArtP und ArtMP wurden mittels Isothermaler Titrationskalorimetrie (ITC) analysiert. Experimente mit der isolierten NBD ArtP lieferten vergleichbare Affinitäten für ATP und ADP (6 µM), während die nicht-hydrolysierbaren Analoga AMPPNP und AMPPCP um Faktoren von 8 bzw. 45 schwächer gebunden wurden. Die Affinität des detergenz-gelösten ArtMP-Komplexes für ADP lag bei 13 µM, wohingegen sowohl AMPPNP als auch AMPPCP mit KDs von etwa 70 µM gebunden wurden.Interessanterweise verlief die Interaktion von ArtMP und ADP endotherm, während alle anderen Nukleotide exotherme Bindungsreaktionen zeigten. Im nächsten Schritt wurden strukturelle Veränderungen in ArtP hervorgerufen durch Nukleotidbindung wurden zunächst mittels Lösungs-NMR-Spektroskopie analysiert. Die Bindung von ATP und ADP führte zu identischer Beinflussung der Chemischen Verschiebungen, im Einklang mit den vergleichbaren KD-Werten und suggeriert damit ähnliche strukturelle Eigenschaften der Komplexe. 1H-detektierte Festkörper-NMR-Spektroskopie wurde anschließend verwendet um nukleotidabhängige Effekte innerhalb des funktionalen ArtMP-Komplexes in Lipidumgebung zu untersuchen. Als Voraussetzung für diese Analyse wurden initiale Signalzuordnungen für die ArtP-Untereinheit aus Kombination einer verfügbaren Lösungs-NMR-Zuordnung für ArtP mit 1H-detektierten dreidimensionalen Festkörper-NMR-Experimenten für den lipidumschlossenen Transporter erhalten. Die Kreuzsignale für Amidprotonen der zugeordneten Aminosäurereste konnten als sensitive Monitore für ADP- und AMPPCP-induzierte konformationelle Änderungen von ArtP innerhalb des ArtMP-Komplexes verwendet werden. Viele der beobachteten Effekte auf die Chemischen Verschiebungen in den Spektren des vollständigen Komplexes ähnelten den Beobachtungen in Lösungs-NMR-Experimenten mit isoliertem ArtP. Bemerkenswerterweise wurden auch Signale für Regionen abseits der Nukleotidbindetasche durch Anwesenheit von Nukleotid beeinflusst. Die Integration von Daten aus Lösungs- und Festkörperexperimenten sowie eines einfachen Homologiemodells für ArtMP, ermöglicht Rückschlüsse auf eine potentielle Route zur Weitergabe nukleotidbedingter struktureller Veränderungen in Richtung der Interaktionsfläche zwischen ArtP und ArtM. Im Hinblick auf eine vollständige Resonanzzuordnung für ArtMP wurden 1H-detektierte Experimente bei einer MAS- Frequenz von 40 kHz durchgeführt. Mehrere Präparationen wurden untersucht, darunter Proben die entweder die NBD (ArtP) oder die TMD (ArtM) in dreifach- markierter Form enthielten, während die andere Domäne mit Isotopen in natürlicher Häufigkeit vorlag. In den entsprechenden grundlegenden Dreifachresonanz-Experimenten (hCaNH und hCoNH) wurden über 80 % der erwarteten Signale für ArtP detektiert. Weitere Experimente, welche Korrelationen über Amidbindungen liefern, komplettieren diesen Assignment-Satz und ermöglichen die vollständige strukturelle Charakterisierung des Transporters. Im Rahmen einer weitergefassten Perspektive wurden die hergestellten Proben in Projekten zur Weiterentwicklung der NMR-Technologie verwendet, wobei beispielsweise Deuterium in Quadruple-Resonance-Experimente einbezogen wurde. Durch Kombination von Deuteriumanregung mit der Detektion von Protonen wurden zusätzliche Kreuzsignale in 3D-Experimenten erhalten, welche in Dreifachresonanzexperimenten, die ausschließlich auf Manipulation von Protonen, Kohlenstoff und Stickstoff basierten, nicht auftraten. Dies lässt vermuten, dass ArtM abgeschirmte Regionen enthält, die unzureichenden Protonenrücktausch an labilen Gruppen aufweisen. Diese Regionen sind mit Pulssequenzen, die mit einem initialen Kreuzpolarisationstransfer von 1H auf 13C beginnen, schwer zu untersuchen. Für integrale Membranproteine, die nicht vollständig ent- und zurückgefaltet werden können um ausreichenden Protonenrücktausch zu gewähren, bietet diese neue Methode eine wertvolle Alter-native für strukturelle Untersuchungen (publiziert in Akbey et al., 2014). Diese Studie kann als Beispiel für die Anwendung 1H-detektierter fast- spinning ssNMR-Spektroskopie zur die Untersuchung biologischer Funktionen für komplexe Multikomponentensysteme angesehen werden. Sie repräsentiert eine der ersten Umsetzungen dieser Technik zur Detektion von Ligandenbindung mittels Verfolgung konformationeller Veränderungen infolge der Nukleotidbindung an lipidumschlossenes ArtMP.","161 S.","https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/3318||http://dx.doi.org/10.17169/refubium-7518","urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000098306-6","eng","http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen","ABC Transporter||solution NMR||Solid-state NMR||membrane protein||isotopic labeling","500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::572 Biochemie","Structural Characterization of a Transmembrane Protein by Solid-state NMR","A Biophysical and Functional Study of the ABC Transporter ArtMP-J","Strukturelle Charakterisierung eines Transmembranproteins mittels Festkörper- Kernmagnetresonanzspektroskopie","Eine biophysikalische und funktionale Studie am ABC Transporter ArtMP-J","Dissertation","free","open access","Text","Biologie, Chemie, Pharmazie","FUDISS_derivate_000000016410","FUDISS_thesis_000000098306"