id,collection,dc.contributor.author,dc.contributor.firstReferee,dc.contributor.furtherReferee,dc.contributor.gender,dc.date.accepted,dc.date.accessioned,dc.date.available,dc.date.issued,dc.description.abstract[de],dc.description.abstract[en],dc.format.extent,dc.identifier.uri,dc.identifier.urn,dc.language,dc.rights.uri,dc.subject.ddc,dc.subject[en],dc.title,dc.type,dcterms.accessRights.dnb,dcterms.accessRights.openaire,dcterms.format,refubium.affiliation "becd91c4-f33b-4196-973b-f92dc3a063c2","fub188/14","Grünbein, Marie Luise","Bittl, Robert","Schlichting, Ilme","female","2021-02-19","2021-05-06T08:59:27Z","2021-05-06T08:59:27Z","2021","Proteinstruktur und –funktion sind eng miteinander verbunden. Um die zugrundeliegenden Mechanismen aufzuklären, ist es daher von hohem Interesse, strukturelle Änderungen während einer Reaktion zu verfolgen. Die Entwicklung serieller Femtosekunden-Kristallographie (SFX) an Freie-Elektronen-Lasern im Röntgenbereich (XFEL) hat folglich durch die einmalige Kombination von atomarer räumlicher und Femtosekunden zeitlicher Auflösung viel Aufmerksamkeit erregt, da sie beispiellose Einblicke in die Struktur und Dynamik von Proteinen erlaubt. XFEL Pulse besitzen eine solch hohe Intensität, dass die Probe letztendlich zerstört und für jeden Puls ein neuer Proteinkristall benötigt wird. Ein Flüssigkeitsstrahl (Jet) liefert daher kontinuierlich frisches Material. Mit diesem Ansatz lassen sich auch lichtgesteuerte Reaktionen beobachten, indem ein optischer Puls die Reaktion in einem Kristall aus photosensitiven Proteinen startet, und der Röntgenpuls nach einer festgelegten Zeit das System abfragt. Bei dieser Herangehensweise gibt es zwei grundlegende Probleme: Erstens müssen geeignete Bedingungen zum Starten der Reaktion gefunden werden. Zweitens ist an XFELs der ersten Generation die Messung schwacher Signale durch die geringe Repetitionsrate (≤ 120 Hz) limitiert, die zudem zu einem hohen Probenverbrauch führt. Diese Arbeit hat daher zwei Ziele: Im ersten Teil wurden Methoden entwickelt, die die Grundlage für das Verfolgen der ultraschnellen lichtinduzierten Isomerisierung in Bacteriorhodopsin mittels SFX bildet. Anknüpfend daran wurden die Anregungsintensität ändernde Licht-Materie-Wechselwirkungen mithilfe von Experimenten und Berechnungen quantifiziert, sodass ein allgemeiner Leitfaden für die Bestimmung passender Anregungsbedingungen aufgestellt werden konnte. Dies ist ein entscheidender Schritt für das Vermeiden biologisch irrelevanter Multiphotonen-Effekte. Im zweiten Teil der Arbeit wurden die Chancen und Herausforderungen von SFX an neuen XFELs untersucht, die Röntgenpulse mit bis zu MHz Wiederholrate produzieren können und dadurch versprechen, Durchsatz und Probeneffizienz zu erhöhen. Durch die kurzen Pulsabstände entstehen jedoch neue Probleme: einerseits muss die Zufuhr neuer Kristalle in den Strahl schnell genug geschehen. Andererseits wurde gezeigt, dass der XFEL Puls im Jet Schockwellen auslöst, die die Probe schädigen und so die Messung mit schnell aufeinanderfolgenden Pulsen beeinträchtigen könnte. In dieser Arbeit wurden erste Experimente bei MHz Wiederholrate durchgeführt und beide Problematiken untersucht. Messungen bei 1.1 MHz konnten erfolgreich ohne Beeinträchtigung durchgeführt werden. Es wurde aber auch gezeigt, dass bei kürzeren Pulsintervallen (entsprechend 4.5 und 9.2 MHz) die Schockwelle die Probe schädigen kann und dadurch zu einer reduzierten Auflösung der Kristalle, sowie zu Strukturänderungen im Protein führen können. Die Ergebnisse dieser Arbeit sind wegweisend für das Ausschöpfen der vielversprechenden Möglichkeiten von MHz XFELs, insbesondere für das Beobachten biologisch relevanter, ultraschneller, lichtinduzierter Reaktionen in Proteinen.","Protein structure and function are intimately connected. To deduce the mechanisms underlying specific functions, it is therefore of high interest to investigate structural changes during a reaction. Recently, the development of serial femtosecond crystallography (SFX) at X-ray free-electron lasers (XFELs) has attracted a great deal of attention by enabling time-resolved (TR) experiments at atomic spatial and femtosecond temporal resolution, thereby allowing unprecedented insight into protein dynamics. The high intensity of the XFEL pulse destroys any sample that has been exposed to the focused beam. A new protein crystal thus needs to be supplied for each pulse. This is typically achieved using a continuously flowing jet. For light-triggered reactions, an optical pulse starts the reaction in crystals of photosensitive proteins and the X-ray pulse then interrogates the system after a given time interval. For such experiments there are two main issues: First, appropriate conditions have to be found for triggering the reaction of interest. Second, the measurement of weak signals is severely limited by the low data collection rate (≤ 120 Hz) at first-generation XFELs. Moreover high sample consumption is an issue at these X-ray sources. The goals of this thesis were therefore twofold: In the first part, techniques were developed to enable studying the ultrafast isomerization following photon absorption by bacteriorhodopsin in a TR-SFX experiment. Extending these results, light-matter interactions changing the incident excitation intensity were quantified based on experiments and calculations. This allowed establishing guidelines how to generally determine appropriate excitation conditions in SFX employing light triggering. These findings are fundamental to avoid multiphoton artefacts arising from excessive excitation and are thus essential for studying biological reactions which take place almost exclusively in the single photon regime. In the second part of this thesis, opportunities and challenges of SFX experiments at next-generation XFELs were explored. These new machines generate X-ray pulses at MHz peak repetition rate and promise significantly higher throughput and more efficient sample usage. However, the short spacing between pulses introduces new challenges: it needs to be ensured that fresh sample is supplied sufficiently fast for each X-ray pulse. Moreover, it has been shown that the XFEL pulse launches shock waves in the sample carrying jet. These may damage sample probed by subsequent pulses. Here, first experiments at MHz peak repetition rate were conducted to investigate both issues. It was demonstrated that data collection of undamaged sample is indeed possible at 1.1 MHz repetition rate. At shorter pulse intervals (corresponding to 4.5 and 9.2 MHz), shock wave induced damage may lead to a significant loss in diffraction resolution of the crystal and even to structural changes in the protein. Together, the results of this thesis delineate the limitations of (TR-) SFX due to XFEL induced shock damage and pave the way towards exploiting the promising capabilities of MHz XFELs, in particular for studying biologically relevant light-triggered reactions in proteins.","ix, 135 Seiten","https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/30029||http://dx.doi.org/10.17169/refubium-29771","urn:nbn:de:kobv:188-refubium-30029-3","eng","http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen","500 Naturwissenschaften und Mathematik::530 Physik::530 Physik","Biophysics||X-ray free-electron lasers (XFELs)||Serial femtosecond crystallography (SFX)||Optical excitation of light-sensitive protein crystals||Time-resolved crystallography||MHz repetition rate data collection at XFELs","Studying protein dynamics with X-ray free-electron lasers: Opportunities & Limitations","Dissertation","free","open access","Text","Physik"