id,collection,dc.contributor.author,dc.contributor.firstReferee,dc.contributor.furtherReferee,dc.contributor.gender,dc.date.accepted,dc.date.accessioned,dc.date.available,dc.date.embargoEnd,dc.date.issued,dc.description.abstract[de],dc.description.abstract[en],dc.format.extent,dc.identifier.uri,dc.identifier.urn,dc.language,dc.rights.uri,dc.subject.ddc,dc.subject[de],dc.subject[en],dc.title,dc.title.translated[en],dc.type,dcterms.accessRights.dnb,dcterms.accessRights.openaire,dcterms.accessRights.proquest,dcterms.format,refubium.affiliation,refubium.note.author "ee11c071-503c-41f9-87de-13226e3152eb","fub188/14","Fischer, Christina","Rademann, Jörg","Freund, Christian","female","2019-09-13","2020-09-14T08:17:18Z","2020-09-14T08:17:18Z","2020-09-12","2020","Multivalente Peptid-Polymerkonjugate bieten ein bislang weitgehend ungenutztes Potential als Inhibitoren für Protein-Protein Interaktionen. Hierbei sind insbesondere ihre proteolytische Beständigkeit und die mögliche Zellpermeabilität von Interesse. Des Weiteren können durch eine multivalente Präsentation Affinitätssteigerung gegenüber ihren Zielstrukturen im Vergleich zu ihren monovalenten Pendants erreicht werden. Somit könnten potentiell potente Inhibitoren entwickelt werden. In der vorliegenden Arbeit wurden Dextrankonjugate als multivalente, zellgängige Inhibitoren der Tandem-WW-Domäne des pre-mRNA Splicingproteins FBP21 und der West-Nil-Virus Protease NS2B-NS3 eingesetzt. Hierbei sollte besonders die funktionelle Untersuchung der multivalenten Inhibitoren in vitro und in vivo im Fokus dieser Arbeit stehen. Als inhibitorische Funktionspeptide dienten zwei Prolin-reiche Sequenzen, das affine Peptid WPPPPRVPR (W) und die hochaffine Sequenz WPPPPRVPRWPPPPRVPR (W2), die bereits als monovalente Peptide eine gute Bindungsaffinität zum FBP21 aufwiesen. Die Beladung der synthetisierten Konjugate konnten mittels eigens entwickelter Analysemethodik in einer Kombination aus NMR- und Absorptionsspektroskopie bestimmt werden. Die so ermittelten Molmassen ließen sich mittels Gelpermeationschromatographie verifizieren. Weiterführend wurden die Bindungsaffinitäten der Konjugate zum FBP21 anhand isother-maler Titrationskalorimetrie ermittelt. Hierbei zeigten Konjugate, die das hochaffine Peptid trugen im Vergleich mit der affinen W-Sequenz eine stärkere Bindungsaffinität bei geringerer Beladungszahl. Somit wurden die hochaffinen W2-Konjugate für die weiteren biochemischen Untersuchungen eingesetzt. Da das FBP21 im Zellnukleus lokalisiert ist, sollte die nukleare Aufnahme der Konjugate induziert werden, um eine Inhibition des FBP21 bewirken zu können. Hierfür wurde eine Kombination aus zellpenetrierendem Peptid und Kernlokalisationssequenz untersucht. Die endosomale Freisetzung der Konjugate in das Zytosol und anschließende Aufnahme in den Zellkern wurde durch die gewählte Kombination der zellpenetrierenden Peptide in Verbindung mit dem hochaffinen Funktionspeptid erreicht. Hierbei war jedoch die Bela-dung der Dextrane mit den jeweiligen Peptidspezies nicht beliebig wählbar, da bei hohen Beladungszahlen eine Zytotoxizität der Konstrukte, hervorgerufen durch die biologische Aktivität des Inhibitors, auftrat. Nachdem die Zellaufnahme bestätigt werden konnte, wurde die Splicingaktivität der hochaffinen Peptid-Dextrankonjugate anhand eines in vitro Splicing-Assays bestimmt. Die multivalente Präsentation der Funktionspeptide schien hierbei ausschlaggebend für den inhibitorischen Effekt der Konjugate zu sein. Abschließend sollte anhand eines Pull-down-Assays die Interaktion der Konjugate mit dem FBP21 bestätigt und potentielle weitere Interaktionspartner ausfindig gemacht werden. Es konnte hierbei eine deutliche Interaktion des Funktionspeptid-tragenden Konjugats mit dem FBP21 gegenüber der Negativkontrolle gesehen werden. Weiterhin wurde auch die Interaktion einer Vielzahl an weiteren Proteinen mit den Konjugaten detektiert, welche zu einem großen Anteil aus dem Splicingzyklus oder nahverwandten Prozessen wie der Transkription stammen. Somit sind die verwendeten Peptid-Dextrankonjugate als PPI-Inhibitoren für das pre-mRNA Splicing einsetzbar. Für die Entwicklung zellgängiger, flaviviraler Inhibitoren wurden Dextrankonjugate syn-thetisiert, die das potente, literaturbekannte Peptidomimetikum Phenacyl-Lys-Lys-GCMA verwendeten. Das Peptidomimetikum wies hierbei selbst nur bei erhöhten Konzentration eine Zellpermeabilität auf. Um eine Zellgängigkeit der Konjugate zu gewährleisten, wurden somit zusätzlich zellpenetrierende Peptide (TAT) an die Dextrane gekuppelt. Bei Untersuchung der Aktivitäten der Inhibitoren zeigte sich, dass die TAT-tragenden Konjugate generell eine bessere Aktivität gegenüber den Flaviviren West-Nil-, Dengue- und Zika-Virus in vitro und in vivo aufwiesen als Konjugate, die nur das Peptidomimetikum trugen. Dieses ist dadurch begründet, dass das TAT-Peptid selbst als Substrat für die NS2B-NS3 Protease wirken kann und somit diese inhibiert. Die Verwendung der Peptidomimetika in Kombination mit dem TAT zeigte hierbei einen multivalenten Effekt der Inhibition.","Multivalent peptide-polymer conjugates offer a largely untapped potential as inhibitors of protein-protein interactions. Especially their stability towards proteolysis and a potential of increased cell permeability are of interest. Furthermore, they exhibit strongly increased binding affinities towards their target structures in comparison to their monovalent entities. Thus, more potent inhibitors could be obtained. In the following work, dextran conjugates have been used as multivalent, cell-penetrating inhibitors for the tandem-WW-domains of the pre-mRNA splicing protein FBP21 and the West Nile virus protease NS2B-NS3. In this context, the dextran conjugates were investigated in depth on their functional properties in in vitro and in vivo experiments. Two proline-rich sequences, the peptide WPPPPRVPR (W) and the high-affinity sequence WPPPPRVPRWPPPPRVPR (W2), were used as inhibitory peptides due to their good binding activities towards FBP21 as monovalent peptides. The loading of the synthesized conjugates could be determined using a specially developed analysis methodology, which combined the use of NMR and absorp-tion spectroscopy. Calculated molecular masses could be confirmed using gel permeation chromatography. Afterwards, the binding affinities of the conjugates were determined with isothermal titration calorimetry. Conjugates bearing the high-affinity W2-peptide showed a higher binding affinity at a lower peptide loading on the dextran than the W-sequence. Consequently, the W2-conjugates were used for the following biochemical investigations. Since FBP21 is localized in the cell nucleus, the nuclear uptake of the conjugates needed to be induced to enable the inhibition of FBP21. Therefore, a combination of a cell-pene-trating peptide and a nuclear localization sequence were investigated. The endosomal release of the conjugates into the cytosol and following uptake into the cell nucleus was successful for a combination of the cell-penetrating peptide system and the functional W2-peptide. Due to high cytotoxicity at high peptide loading, the number of peptides coupled to the dextrans was not freely selectable and has to be taken into consideration. This cytotoxicity was most likely due to the biological activity of the inhibitors and therefore indicated a good potency for the system. After confirmation of the cellular uptake, the splicing activity of the W2-conjugates were investigated using an in vitro splicing assay. The multivalent presentation of the functional peptides seemed to be crucial for the inhibitory effect of the conjugates. Finally, the interaction of the conjugates with FBP21 and the possible interaction with other proteins was investigated with a pulldown assay. The interaction of the W2-bearing conjugate with FBP21 could be seen clearly in comparison with the negative control. Furthermore, a mul-titude of other peptides from the cell lysate bound to the conjugate. Most of the bound proteins were splicing proteins or interaction partners from closely related processes (e.g. transcription). Therefore, the synthesized conjugates can be used as PPI-inhibitors of pre-mRNA splicing. Additionally, dextran conjugates were synthesized as cell-permeable, flavivirale inhibitors. In this case the potent peptidomimetic Phenacyl-Lys-Lys-GCMA was used as the inhibitory component. The peptidomimetic itself only showed cellular uptake at high concentrations. Therefore, to insure cellular uptake of the conjugates, the cell-penetrating peptide TAT was additionally coupled onto the dextran backbone. For activity investigations of the synthesized inhibitors the TAT-bearing conjugates generally showed a higher activity in vitro and in vivo towards the flaviviruses West-Nile, Dengue and Zika compared to purely peptidomimetic conjugates. This enhanced activity is due to the fact that TAT itself can act as a substrate for the NS2B-NS3 protease and therefore inhibit the virus. A combination of both peptidomimetic and TAT leads to an increase cooperative effect of the inhibition.","XVI, 267 Seiten","https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/27330||http://dx.doi.org/10.17169/refubium-27086","urn:nbn:de:kobv:188-refubium-27330-9","ger","https://creativecommons.org/licenses/by-nd/4.0/","500 Naturwissenschaften und Mathematik::540 Chemie::540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften","Peptid-Dextran Konjugate||multivalente Inhibitoren||West-Nil Virus Protease NS2B-NS3","peptide-dextran conjugates||FBP21||West Nile virus||WNV||splicing protein","Multivalente Peptid-Dextrankonjugate als zellgängige Inhibitoren für das pre-mRNA Splicingprotein FBP21 und die West-Nil-Virus Protease NS2B-NS3","Multivalent peptide-dextran conjugates as cell-permeable inhibitors for the pre-mRNA splicing protein FBP21 and the West Nile virus protease NS2B-NS3","Dissertation","free","open access","accept","Text","Biologie, Chemie, Pharmazie","Diese Arbeit entstand als Projekt im Sonderforschungsbereich SFB765."