id,collection,dc.contributor.author,dc.contributor.firstReferee,dc.contributor.furtherReferee,dc.contributor.gender,dc.date.accepted,dc.date.accessioned,dc.date.available,dc.date.issued,dc.description,dc.description.abstract[de],dc.description.abstract[en],dc.format.extent,dc.identifier.uri,dc.identifier.urn,dc.language,dc.rights.uri,dc.subject,dc.subject.ddc,dc.title,dc.title.translated[en],dc.type,dcterms.accessRights.dnb,dcterms.accessRights.openaire,dcterms.format[de],refubium.affiliation[de],refubium.mycore.derivateId,refubium.mycore.fudocsId "c5919e08-1581-43f6-b48d-4274a616fd53","fub188/14","Siegert Carrazedo, Romy","Prof. Dr. Morano","Prof. Dr. Rathjen","w","2012-07-17","2018-06-07T16:26:40Z","2012-07-26T11:38:53.626Z","2012","Abkürzungsverzeichnis......................................................................v 1\. Einleitung.........................................................................................1 1.1 Die Herzmuskulatur................................................................................... 1 1.2 Aufbau und Funktion der Kardiomyozyten............................................. ..1 1.2.1 Das Sarkomer: Der kontraktile Apparat der Kardiomyozyten................1 1.2.2 Querbrückenzyklus: Der Kontraktionsmechanismus der Kardiomyozyten........................................................................... ..3 1.3 Myomesin ist eine essentielle Komponente der M-Bande.......................5 1.4 Struktur und molekulare Eigenschaften des Myomesin-Moleküls....... ..7 1.5 Myomesin ist ein Kandidatengen für die hypertrophe Kardiomyopathie................................................................. 12 1.6 Zielstellung der Arbeit.............................................................................. 14 2\. Material und Methoden.................................................................16 2.1 Materialien................................................................................................. 16 2.1.1 Chemikalien und Reagentien............................................................. 16 2.1.2 Puffer und Stammlösungen................................................................ 19 2.1.3 Restriktionsenzyme........................................................................... 22 2.1.4 Antikörper........................................................................................... 22 2.1.5 Klonierungsvektoren.......................................................................... 23 2.1.6 Bakterienstämme.............................................................................. 23 2.1.7 Zellen.................................................................................................. 23 2.1.8 Kits..................................................................................................... 24 2.1.9 Materialien und Geräte...................................................................... 25 2.1.10 Software........................................................................................... 25 2.1.11 Oligonukleotide................................................................................ 26 2.2 Molekularbiologische und mikrobiologische Methoden....................... 27 2.2.1 Primer- Design.................................................................................... 27 2.2.2 Herstellung der Konstrukte................................................................ 27 2.2.3 Klonierung der Konstrukte................................................................. 28 2.2.4 Restriktionsanalyse.....................................................................….. 29 2.2.5 Ligation....................................................................................…….. 29 2.2.6 Transformation.................................................................................. 29 2.2.7 Mutagenese...................................................................................… 30 2.2.8 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen........................ 30 2.2.9 Isolierung von DNA-Plasmiden aus E. Coli...................................... 30 2.2.10 Konzentrationsbestimmung der DNA............................................... 30 2.2.11 Gelelektrophorese............................................................................ 31 2.2.12 Sequenzierung................................................................................ 31 2.2.13 Herstellung kompetenter Zellen...................................................... 32 2.3 Biochemische Methoden.......................................................................... 33 2.3.1 Expression der rekombinanten Proteine........................................... 33 2.3.2 Isolierung und Reinigung der rekombinanten Proteine..................... 33 2.3.3 SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese............................................. 34 2.3.4 Western Blot...................................................................................... 34 2.3.5 Proteinbestimmung nach Bradford.................................................... 35 2.4 Biophysikalische Methoden..................................................................... 36 2.4.1 Analytische Ultrazentrifugation.......................................................... 36 2.4.1.1 Prinzip der analytischen Ultrazentrifugation................................... 36 2.4.1.2 Durchführung der analytischen Ultrazentrifugation......................... 37 2.4.2 Zirkulardichroismus (CD- Spektroskopie)........................................... 38 2.4.2.1 Das Prinzip der CD-Spektroskopie................................................. 40 2.4.2.2 Durchführung der CD- Spektroskopie............................................. 42 2.4.3 Oberflächen-Plasmon-Resonanz-Spektroskopie (SPR)................... 42 2.4.3.1 Prinzip der SPR............................................................................. 43 2.4.3.2 Durchführung der SPR.............................................. .................... 45 2.4.4 Prinzip und Messung der dynamischen Lichtstreuung(DSL)............ 46 2.4.5 Kristallisation..................................................................................... 47 2.5 Zellkultur- Methoden.................................................................................. 47 2.5.1 Präparation neonataler Kardiomyozyten........................................... 47 2.5.2 Kultivierung neonataler Kardiomyozyten.......................................... 48 2.5.3 Transfektion neonataler Kardiomyozyten.......................................... 49 2.5.4 Fixierung und Färbung neonataler Kardiomyozyten......................... 49 2.6 Mikroskopie.............................................................................................. 50 2.7 Statistische Auswertungen..................................................................... 50 3\. Ergebnisse.................................................................................... 51 3.1 Herstellung der Konstrukte..................................................................... 51 3.1.1 Amplifizierung der Konstrukte........................................................... 51 3.1.2 Klonierung der Konstrukte................................................................ 53 3.1.3 Identifizierung der klonierten Konstrukte........................................... 58 3.1.4 Herstellen der Mutanten V1490I....................................................... 60 3.2 Herstellung der rekombinanten Proteine.............................................. 61 3.2.1 Expression und Aufreinigung von My11-13WT und My11-13V1490I..…..61 3.2.2 Expression und Aufreinigung von My11-12WT, My11-12V1490I, My12-13WT und My12-13V1490I………………………………………….. 64 3.2.3 Identifizierung der rekombinanten Proteine...................................... 64 3.3 Strukturanalyse der rekombinanten Proteine........................................ 65 3.3.1 Untersuchungen zu den Dimerisierungseigenschaften von My11-13WT und My11-13V1490I ...................................................65 3.3.2 Sekundärstruktur der rekombinanten Proteine................................ 66 3.3.3. Hitzestabilität der rekombinanten Wildtypdimere............................ 68 3.3.4 Einfluss der Mutation V1490I auf die Thermostabilität der Myomesin- Dimere............................................................................ 69 3.4 Effekt der Mutation V1490I auf die Bindungssaffinität von My11-13 und My12-13.............................................................................................. 74 3.5 Das Verhalten der mutierten Myomesin-Dimere bei höheren Konzentrationen....................................................................... 77 3.6 Kristallisation von My11-12WT.................................................................. 78 3.7 Untersuchungen von My11-13WT und My11-13V490I in neonatalen Kardiomyozyten....................................................................................... 79 3.7.1 Bildung von Myomesin-Aggregaten bei kürzeren Expressionszeiten............................................................................. 81 3.7.2 Unterschiede im Verhalten der Myomesin-Aggregate zwischen My11-13WT und My11-13V1490I...........................................................84 4\. Diskussion.....................................................................................86 5\. Zusammenfassung.......................................................................96 6\. Literaturverzeichnis......................................................................99 7\. Anhang.........................................................................................108 7.1 Vektorkarten..................................................................................... ........108 7.2 Nukleotid- und Aminosäuresequenzen..................................................112 Publikationen und Posterpräsentationen.....................................124 Lebenslauf.......................................................................................125 Erklärung.........................................................................................126","Myomesin, ein 185 kDa großes Protein, das aus 13 Immunglobin- und Fibronektin- Domänen besteht, spielt eine wichtige Rolle für die Struktur und Funktion der M-Bande des Sarkomers aller höherer Vertebraten. Die C-terminale Myomesindomäne 13 bildet antiparallele Dimere, welche die benachbarten Myosinfilamente sowie Titin in der M-Bande quer vernetzen. Diese Interaktionen dienen der Stabilisierung des kontraktilen Apparates während der Muskelkontraktion. In einer früheren Arbeit wurde bei einer Familie mit hypertropher Kardiomyopathie (HCM) eine Mutation in der Myomesindomäne 12 identifiziert, bei der Valin durch Isoleucin an der Aminosäureposition 1490 ersetzt wird (V1490I). Um den Effekt der Mutation V1490I auf die Struktur und Funktion der Myomesindomänen My11-13, My11-12 und My12-13 zu untersuchen, wurden in meiner vorliegenden Arbeit Analytische Ultrazentrifugation, Zirkulardichroismus, Oberflächen-Plasmon-Resonanz-Analyse sowie ein „Sarcomeric Sorting Assay“ der entsprechenden Myomesinfragmente durchgeführt. Sowohl die Wildtypfragmente (WT) als auch die mutierten Myomesinfragmente (V1490I) lagen bei Konzentrationen bis zu 10 μM als stabile Dimere vor. Der „Sarcomeric Sorting Assay“ in neonatalen Kardiomyozyten zeigte, dass sich die normalen und mutierten rekombinanten Myomesinfragmente in die M-Bande integrieren. Dieses Ergebnis ließ darauf schließen, dass die rekombinanten Myomesinfragmente die strukturellen und funktionellen Eigenschaften nativen Myomesins besaßen. Die mutierten Myomesinfragmente wiesen dabei jedoch andere strukturelle und funktionelle Eigenschaften auf als die entsprechenden Wildtypfragmente. Die mutierten Myomesindimere My11-13V1490I und My12-13V1490I besaßen eine geringere Thermostabilität als die Wildtypen My11-13WT und My12-13WT. Das Myomesinmonomer My11-12V1490I, bei dem die Dimerisierungsdomäne 13 fehlte, wies dagegen keinen Unterschied zum Wildtyp My11-12WT auf. Tatsächlich waren die Bindungssaffinitäten von My 11-13V1490I und My12-13V1490I signifikant verändert. Beide Ergebnisse belegten eine Störung der Myomesindimerisierung über Domäne 13. Neben der anormalen Dimerisierung verursachte die V1490I Mutation weitere Funktionsveränderungen. Konzentrationen ab 10 μM führten zur Aggregation von My11-13V1490I, während My11-13WT weiterhin als stabiles Dimer vorlag. In neonatalen Kardiomyozyten zeigte My11-13V1490I einen verzögerten Einbau in die M-Bande der Sarkomere. Die anormale Dimerisierung, Multimerisierung sowie der verzögerte Einbau in die M-Bande von mutiertem Myomesin (V1490) könnte die Sarkomerstabilität beinträchtigen und schließlich zur Entstehung der hypertrophen Kardiomyopathie (HCM) beitragen.","Myomesin is a 185 kDa protein and consists of 13 immunoglobulin-like and fibronectin type III domains. It plays an important structural and functional role in the M-band of striated muscles of all higher vertebrates. The C-terminal myomesin domain 13 dimerises and forms antiparallel strands which cross-link neighboring myosin filaments and titin in the M-line of the sarcomere. These interactions stabilise the contractile apparatus during striated muscle contraction. In a previous study a missense mutation in the myomesin domain 12 was identified in a family with inherited hypertrophic cardiomyopathy (HCM), in which valine at amino acid position 1490 was substituted by isoleucine. Analytical ultracentrifugation experiments, circular dichroism spectroscopy, Surface Plasmon Resonance studies and a sarcomeric sorting assay in neonatal cardiomyocytes of myomesin fragments were carried out in this study to investigate the effects of the mutation V1490I on structure and function of myomesin domains My11-13, My11-12 and My12-13. Both the wild type and mutated myomesin domains My11-13 formed stable dimers at concentrations below 10 μM. The sarcomeric sorting assay showed that normal and mutated myomesin fragments My11-13 integrated in the M-band of the sarcomere, confirming that the recombinant myomesin fragments had comparable structural and functional properties of native myomesin. But mutated myomesin fragments showed different structural and functional properties than the corresponding wild type proteins. Mutated myomesin dimers My11-13V1490I and My12-13V1490I revealed a reduced thermal stability. However, monomeric myomesin fragment My11-12, i.e. without dimerisation domain 13 showed no difference in thermal stability between wild type and V1490I mutated myomesin. In fact binding affinities of My11-13V1490I and My12-13V1490I changed significantly. Both results allocated disturbance of myomesin dimerisation via domain 13. In addition to abnormal dimerisation mutation V1490I caused further functional changes. Concentrations above 10 μM led to aggregation of mutated myomesin My11-13V1490I, while wild type My11-13 formed stable dimers. In neonatal cardiomyocytes My11-13V1490I showed decelerated incorporation into the M-band of the sarcomere. In conclusion, the abnormal dimerisation, multimerisation and M-band incorporation of mutated myomesin may affect proper sarcomere stability and thereby may contribute to the pathogenesis of hypertrophic cardiomyopathy (HCM).","126 S.","https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/2541||http://dx.doi.org/10.17169/refubium-6742","urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000038477-6","ger","http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen","Myomesin||Hypertrophic cardiomyopathy||Mutation||Protein structure||Thermal stability||Analytical ultracentrifugation","500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie","Untersuchungen der strukturellen und funktionellen Konsequenzen einer Mutation im Myomesin-Gen","Studies of structural and functional consequences of a mutation in the gene myomesin","Dissertation","free","open access","Text","Biologie, Chemie, Pharmazie","FUDISS_derivate_000000011673","FUDISS_thesis_000000038477"