id,collection,dc.contributor.author,dc.contributor.firstReferee,dc.contributor.furtherReferee,dc.contributor.gender,dc.date.accepted,dc.date.accessioned,dc.date.available,dc.date.embargoEnd,dc.date.issued,dc.description,dc.description.abstract[de],dc.identifier.uri,dc.identifier.urn,dc.language,dc.rights.uri,dc.subject,dc.subject.ddc,dc.title,dc.title.subtitle,dc.title.translated[de],dc.title.translatedsubtitle[de],dc.type,dcterms.accessRights.dnb,dcterms.accessRights.openaire,dcterms.format[de],refubium.affiliation[de],refubium.mycore.derivateId,refubium.mycore.fudocsId,refubium.mycore.transfer "8c208b3f-99d6-466d-8980-d0071b44aec1","fub188/14","Khare, Dheeraj","Prof. Dr. Udo Heinemann","Prof. Dr. Volker A. Erdmann","n","2004-06-15","2018-06-07T15:57:22Z","2004-06-21T00:00:00.649Z","2004-06-23","2004","1\. Title Page 2\. Introduction 8 3\. Material and Methods 29 4\. Results 38 5\. Discussion 67 6\. Sleeping Beauty Transposase 78 7\. References 87 8\. Appendix 96","DNA-binding proteins play a central role in all aspects of genetic activity within an organism, such as transcription, DNA rearrangement, replication and repair. It is therefore extremely important to analyse the nature of the complexes that are formed between proteins and DNA, as they form the basis of our knowledge of how these processes occur. Partitioning of low copy-number plasmids at cell division is quite similar to mitosis in that, before cell division, paired plasmid molecules are separated from each other and actively moved apart. There are three components that are essential for partitioning to occur, two plasmid encoded proteins and a cis-acting centromere-like site on the plasmid DNA. The first gene of the partition operon involves either an ATPase with Walker-type ATP binding motifs (ParA) or an evolutionary unrelated actin-type-ATPase (ParM). The second partition protein (ParB or ParR) binds to the cis-acting DNA partition site and recruits the ATPase into the nucleoprotein complex. Genes for homologues of ParA and ParB exist on many bacterial chromosomes and plasmids. The IncPα plasmids, exemplified by the low copy-number plasmid RP4, encode for an active partitioning system with homologues of ParA and ParB partitioning proteins called IncC, a putative ATPase, and KorB, a specific DNA-binding protein, respectively. Although KorB has a net negative charge (pI = 4.6), it recognizes and binds specifically to palindromic operator OB (consensus sequence 5´ TTTAGCG/CGCTAAA 3´) occurring at 12 different sites on the plasmid (opera­tors OB1 to OB12), 6 of which are involved in transcriptional regulation. The KorB protein acts as a multifunctional regulator in control circuits of plasmid housekeeping genes involved in replication, maintenance and conjugation. Additionally, KorB functions as the ParB homologue of the plasmid's partitioning system. The major part of the work presented in this thesis concerns the crystal structure of the DNA-binding domain of a global regulator, KorB. This work reveals for the first time the structural basis of DNA binding of a family member of the ParB DNA partitioning factors to its recognition sequence. In this thesis, the X-ray crystal structure of the complex comprising the DNA-binding domain of KorB (KorB-O) and its operator sequence OB, determined to 2.2-Å resolution, is presented. The KorB-O�OB complex crystallized in spacegroup P3221 with cell parameters a = 110.44 Å, c= 160.53 Å, with two copies of the complex in the asymmetric unit. Each half-site of the palindromic operator DNA binds one copy of the protein into the major groove. The KorB-O bound operator DNA adopts a standard B-DNA conform­a­tion with a straight helix axis. The protein structure consists of eight helices two of which belong to a canonical helix- turn-helix DNA-binding motif. The α3-turn-α4 segment of KorB-O has a sequence signature and conformation typical for a helix-turn-helix motif generally involved in specific DNA major groove interactions. However, residues from these two helices do not form direct base contacts in the OB region. The structure reveals mainly two residues, Thr211 and Arg240, which recognize the OB sequence through direct hydrogen bonding. This was further confirmed by mutagenesis, where mutant KorB proteins Thr211Ala and Arg240Ala do not recognize OB specifically suggesting that the mode of operator binding by the KorB-O fragment observed in the crystal structure reflects the specific DNA binding of the wildtype protein. The outer surface of the DNA-bound KorB-O mirrors the overall acidity of KorB, whereas DNA binding occurs via a basic interaction surface. A model of KorB including the structure of its dimerization domain is presented that considers the inter­action with the highly basic ParA homologue IncC. The last chapter of the thesis describes work done to characterize and crystallize the DNA-binding domain of the transposase ""Sleeping Beauty"" of vertebrate origin. Efforts were made to purify and crystallize different constructs of the N-terminal DNA binding domain. In particular, a protocol is presented for the purification of an active form of the full-length transposase.||DNA-bindende Proteine spielen für alle Aspekte der genetischen Aktivität eines Organis­mus, wie bei der Transkription, der Rekombination der DNA, ihrer Replikation und ihrer Reparatur eine zentrale Rolle. Sie müssen die DNA sequenzspezifisch erkennen und mit ihr wechselwirken, so dass die in der DNA verschlüsselte Information abgelesen werden kann. Demzufolge ist es sehr wichtig, die Natur von DNA-Protein-Komplexen zu analy­sie­ren. Ihre Strukturen bilden die Voraussetzung für das Verständnis der genannten Prozes­se. Die Partitionierung von Plasmiden geringen Kopienzahl bei der Zellteilung ist dem Prozess der Mitose dahin gehend verwandt, dass gepaarte Plasmidmoleküle von einander getrennt und aktiv räumlich separiert werden. Drei Komponenten sind für die Teilung notwendig: zwei plasmidkodierte Proteine und ein cis-aktiver Zentromer-ähnlicher Abschnitt der Plasmid-DNA. Das erste Gen auf dem Partitions-Operon kodiertt entweder für eine ATPase mit Walker-ähnlichem ATP- Bindungsmotiv (ParA) oder eine evolutio­när nicht verwandte Aktin-ähnliche ATPase (ParM). Das zweite Partitionsprotein (ParB oder ParR) bindet an den cis-aktiven DNA-Partitionierungsabschnitt und erlaubt der ATPase die Bindung an den Nukleo-Proteinkomplex. Gene für ParA- und ParB-Homolo­ge existieren auf vielen bakteriellen Chromosomen und Plasmiden. Die IncPα-Plasmide, hier am Beispiel des ""low-copy-number""-Plasmids RP4 erläutert, kodieren für ein aktives Partitionierungssystem. Seine Homologe der Teilungsproteine ParA und ParB sind IncC, eine mutmaßliche ATPase und KorB, ein sequenzspezifisch DNA- bindendes Protein. Trotz seiner negativen Gesamtladung (pI = 4.6), erkennt und bindet KorB spezifisch die palindromische Operatorsequenz OB (Konsensussequenz 5´ TTTAGCG/CGCTAAA 3´) an 12 verschiedenen Orten des Plasmids (Operatoren OB1 bis OB12). Sechs dieser Abschnitte sind in die Transkriptionsregulierung involviert. Die KorB-Proteine wirken als multifunktionelle Regulatoren der Kontrollabschnitte von Plasmidgenen, welche an der Replikation, Erhaltung und Konjugation beteiligt sind. KorB stellt das ParB-Homologe im Partitionierungssystem des Plasmids dar. Der Hauptteil dieser Arbeit widmet sich der Kristallstruktur der DNA-bindenden Domäne des globalen Regulators KorB. Es wird erstmalig die strukturelle Grundlage der DNA-Bindung eines Proteins der ParB-Familie an seine Erkennungssequenz beschrieben. Die Röntgenkristallstruktur des Komplexes zwischen der DNA-Bindungsdomäne von KorB (KorB-O) und seiner Operatorsequenz OB wurde bei 2.2 Å Auflösung entschlüsselt. Jede Hälfte der palindromischen Operator-DNA bindet eine Kopie des Proteins in der groβen Furche. Die Proteinstruktur umfasst acht Helices, von denen zwei zu einem ""Helix-Turn-Helix""-Motiv (HTH) gehören. Das α3-turn-α4-Segment des KorB-O besitzt eine Sequenzsignatur und Konformation, die für Proteine typisch ist, welche spezifische Interaktionen innerhalb der großen Furche doppelsträngiger DNA eingehen. Aminosäure­seiten­ketten des HTH- Motivs bilden jedoch keinen direkten Kontakt mit Basenpaaren der OB-Region aus. Es wurden vielmehr zwei Reste, Thr211 und Arg240, außerhalb des HTH- Motivs identi­fi­ziert, die die OB Sequenz durch direkte Wasserstoffbrückenbindungen erkennen. Dies wurde durch gerichtete Mutagenese bestätigt: Die Proteinvarianten Thr211Ala und Arg240Ala sind nicht in der Lage, OB spezifisch zu erkennen. Dies weist darauf hin, dass die Art der Operatorbindung durch das KorB-O Fragment, die in der Kristallstruktur beob­achtet wurde, die spezifische DNA-Bindung des intakten Wildtyp-Proteins wider­spiegelt. Die DNA-abgewandte Oberfläche des KorB-O trägt eine negative Nettoladung, wohingegen die DNA-Bindung über eine basische Oberfläche erfolgt. Ein die C-termi­nale Dimerisie­rungs­domäne einschließendes Modell des KorB- DNA-Komplexes zeigt einen vollständigen Einschluss des DNA-Doppelstrangs durch das Protein und erlaubt eine Diskussion seiner Wechselwirkung mit dem stark basischen ParA-Homologen IncC. Das letzte Kapitel dieser Arbeit fasst Arbeitsschritte zur Charakterisierung und Kristalli­sa­tion der DNA- Bindungsdomäne der Transposase ""Sleeping Beauty"" zusammen. Neben der Reinigung und Kristallisation verschiedener Konstrukte der N-terminalen DNA- Bindungsdomäne dieser Vertebraten-Transposase wurde vor allem ein Protokoll für die Reinigung einer aktiven Form der intakten Transposase etabliert.","https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/1838||http://dx.doi.org/10.17169/refubium-6040","urn:nbn:de:kobv:188-2004001554","eng","http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen","Crystal structure/IncP/plasmid partitioning/protein-DNA complex/transcription factor","500 Naturwissenschaften und Mathematik::540 Chemie::540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften","Crystallographic and Functional Study on DNA Binding Proteins","Repressor and Partitioning Protein KorB from RP4 Plasmid and the Transposase","Kristallographische und funktionelle Studie zu DNA-bindenden Proteinen:","das Repressor- und Partitionsprotein KorB des Plasmids RP4 und die vertebrate Transposase ""Sleeping Beauty""","Dissertation","free","open access","Text","Biologie, Chemie, Pharmazie","FUDISS_derivate_000000001282","FUDISS_thesis_000000001282","http://www.diss.fu-berlin.de/2004/155/"