id,collection,dc.contributor.author,dc.contributor.firstReferee,dc.contributor.furtherReferee,dc.contributor.gender,dc.date.accepted,dc.date.accessioned,dc.date.available,dc.date.issued,dc.description,dc.description.abstract[de],dc.description.abstract[en],dc.format.extent,dc.identifier.uri,dc.identifier.urn,dc.language,dc.rights.uri,dc.subject,dc.subject.ddc,dc.title,dc.title.translated[en],dc.type,dcterms.accessRights.dnb,dcterms.accessRights.openaire,dcterms.format[de],refubium.affiliation[de],refubium.mycore.derivateId,refubium.mycore.fudocsId "8807aa2e-92ea-45be-9bc0-8a6b18fe0e79","fub188/14","Kuntzsch, Dana","Prof. Dr. Jörg-Dieter Schulzke","Prof. Dr. Matthias F. Melzig","w","2013-10-17","2018-06-08T01:33:39Z","2013-11-11T08:08:00.273Z","2013","1 Einleitung 1 1.1 Sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe mit Wirkung auf den Glucocorticoidrezeptor 1 1.1.1 Glucocorticoide 1 1.1.2 Wirkung von Glucocorticoiden durch den Glucocorticoidrezeptor 1 1.1.3 Therapeutischer Einsatz und Nebenwirkung von Glucocorticoiden 3 1.1.4 Sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe als GR-Liganden 5 1.1.4.1 Endiandrin A aus der Pflanze Endiandra anthropophagorum DOMIN 6 1.1.4.2 Ginsenosid Rg1 aus der Pflanze Panax ginseng C.A.MEY 8 1.1.4.3 Saikosaponin D aus der Pflanze Bupleurum falcatum L. 11 1.2 Epithelialer Natriumkanal (ENaC) 13 1.2.1 Molekularer Aufbau des ENaCs 15 1.2.2 Regulation des ENaCs auf transkriptioneller Ebene 17 1.2.3 Regulation des ENaCs 18 1.2.3.1 Nedd4-2 und Sgk-1 19 1.2.3.2 Nedd4-2 und GILZ 20 1.2.4 Gestörte ENaC-Funktion bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen 22 1.2.4.1 Chronisch entzündliche Darmerkrankungen 22 1.2.4.2 ENaC und chronisch entzündliche Darmerkrankung 23 1.3 Zielstellung der Arbeit 25 2 Material und Methoden 26 2.1 Material 26 2.1.1 Pflanzenmaterial 26 2.1.1.1 Herkunft 26 2.1.1.1.1 Bupleurum falcatum L. (Sichelblättriges- Hasenohr), Apiaceae 26 2.1.1.1.2 Bupleurum chinensis DC. (chin. Hasenohr), Apiaceae 27 2.1.1.1.3 Endiandra anthropophagorum DOMIN, Lauraceae 27 2.1.1.2 Phytochemisches Labor 27 2.1.1.2.1 Geräte 27 2.1.1.2.2 Verbrauchsmaterialien 28 2.1.1.2.3 Laborchemikalien 28 2.1.1.2.4 Referenzsubstanzen 28 2.1.2 Eukaryotische Zellkultur 29 2.1.2.1 Zelllinie HT-29/B6-GR 29 2.1.2.2 Zellkultur Labor 29 2.1.2.2.1 Geräte 29 2.1.2.2.2 Verbrauchsmaterialien 30 2.1.2.2.3 Reagenzien 31 2.1.2.2.3.5 Laborchemikalien und andere Reagenzien 31 2.1.2.2.3.6 Inhibitoren 33 2.1.2.2.3.7 Zytokine 33 2.1.2.2.3.8 Verwendete Kits 33 2.1.2.2.3.9 Antikörper 34 2.1.2.2.3.10 Sonden für Real-Time PCR 34 2.1.2.3 Verwendete Software 35 2.1.2.4 Lösungen 35 2.2 Methoden 38 2.2.1 Phytochemische Methoden 38 2.2.1.1 Extraktherstellung 38 2.2.1.2 Dünnschichtchromatographie und Hochleistungsdünnschicht- chromatographie 42 2.2.2 Zellkultur 43 2.2.2.1 Zellkultur-Epithelmodel 43 2.2.2.2 Kryo- Konservierung 44 2.2.2.3 Zugabe von Reagenzien zu eukaryotischen Zellen 44 2.2.2.4 Zytotoxizitätstest 45 2.2.2.5 Transiente Transfektion mittels Lipofektion und Reportergen-Assay 47 2.2.3 Molekularbiologische Methoden 48 2.2.3.1 Gesamt-RNA Isolation 48 2.2.3.1.1 Tierisches Gewebe 48 2.2.3.1.2 Kultivierte Epithelzellen 49 2.2.3.2 Reverse Transkription und Real-time PCR 49 2.2.4 Proteinchemische Methoden 51 2.2.4.1 Gewinnung der Zelllysate 51 2.2.4.2 Proteinbestimmung 52 2.2.4.3 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS- PAGE) 53 2.2.4.4 Western Blot 53 2.2.5 Immunfluoreszenzfärbung und konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie 54 2.2.6 Elektrophysiologische Methoden in Ussing- Kammern 55 2.2.6.1 Elektrophysiologische Messung an humaner Kolonzelllinie HT-29/B6-GR 56 2.2.6.2 Elektrophysiologische Messung an distalem und proximalem Rattenkolon 57 2.2.7 Statistische Analysen 58 3 Ergebnisse 59 3.1 Sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe und ihre Wirkung auf den Glucocorticoidrezeptor 59 3.1.1 Endiandrin A 59 3.1.1.1 Bestimmung der Zytotoxizität von Endiandrin A in humanen Kolonzellen 60 3.1.1.2 Charakterisierung von Glucocorticoidrezeptor-Transaktivierung durch Endiandrin A in humanen Kolonzellen 61 3.1.1.3 Der Effekt von Endiandrin A auf den ENaC- vermittelten Na+-Transport in humanen Kolonzellen 62 3.1.1.4 Regulation des Glucocorticoid-induzierten ENaC durch Endiandrin A im distalen Rattengewebe unter entzündlichen Bedingungen 64 3.1.1.5 Regulation des Glucocorticoid- induzierten ENaC durch Endiandrin A unter entzündlichen Bedingungen in humanen Kolonepithelzellen 68 3.1.1.6 Charakterisierung von Glucocorticoidrezeptor- Transaktivierung durch Endiandrin A unter hormonellen und entzündlichen Konditionen 71 3.1.1.7 Regulation von Glucocorticoidrezeptor-Proteinexpression und mRNA-Level durch Endiandrin A 72 3.1.1.8 Rolle der JNK MAP-Kinase und zelluläre Lokalisation des Glucocorticoidrezeptors 76 3.1.1.9 Rolle der p38 und ERK MAP-Kinase 83 3.1.1.10 Rolle der Serum-und Glucocorticoid- induzierbaren Kinase-(Sgk-)1 88 3.1.1.11 Regulation des ENaCs unter zusätzlicher Butyrat-Stimulation 91 3.1.1.12 Charakterisierung der Auswirkung einer GC-Dosisreduktion auf den epithelialen Na+-Transport unter entzündlichen Bedingungen und unter dem Einfluss von Endiandrin A 94 3.1.2 Endiandra-Extrakt 96 3.1.2.1 Regulation des Glucocorticoid-induzierten ENaC durch den Endiandra- Extrakt im proximalen Rattengewebe unter entzündlichen Bedingungen 96 3.1.2.2 Regulation des Glucocorticoid-induzierten ENaC durch Endiandra-Extrakt in humanen Kolonzellen unter entzündlichen Bedingungen 97 3.1.3 Ginsenosid Rg1 99 3.1.4 Saikosaponin D 101 3.2 Phytochemische Untersuchung von Bupleurum- Extrakten 104 3.2.1 Dünnschichtchromatographie von Bupleurum-Extrakten und Vergleich verschiedener Extraktionsmethoden 104 4 Diskussion 108 4.1 Aktueller Stellenwert von pflanzlichen Glucocorticoidrezeptor-Modulatoren in der Therapie von entzündlichen Erkrankungen 108 4.1.1 Lignane der australischen Pflanze Endiandra anthropophagrum DOMIN als Glucocorticoidrezeptor-Modulatoren 111 4.1.1.1 Beeinflussung des intestinalen epithelialen Na+-Kanals durch Inhaltsstoffe der Endiandra anthropophagorum DOMIN 115 4.1.1.1.1 Rolle der JNK im Endiandrin A-abhängigen Signalweg 118 4.1.1.1.2 Rolle der p38 und ERK im Endiandrin A-abhängigen Signalweg 120 4.1.1.1.3 Rolle der Sgk-1 im Endiandrin A-abhängigen Signalweg 122 4.1.2 Inhaltstoffe aus Panax ginseng C.A.MEY und Bupleurum falcatum L. als Glucocorticoidrezeptor-Liganden 125 4.1.3 Behandlung von chronisch entzündlichen Darmerkrankungen mit pflanzlich angewandeter Medizin 127 4.2 Diskussion der phytochemischen Untersuchung von Bupleurum- Spezies 130 5 Zusammenfassung 134 6 Summary 136 7 Literatur 138 7.1 Verwendete Bücher 156 8 Abkürzungsverzeichnis 157 9 Anhang 160","In den letzten Jahren ist das Interesse an der Phytotherapie stetig gestiegen, wobei inzwi-schen die Aufklärung der phytopharmazeutischen Wirkung von Heilpflanzen im Vordergrund steht, um die therapeutische Verwendung auf Grund von experimentellen Daten zu begründen. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurden pflanzliche Glucocorticoidrezeptor (GR)-Modulatoren im Hinblick auf eine mögliche Anwendbarkeit bei den chronisch-entzündlichen Erkrankungen (CED) Morbus Crohn und Colitis ulcerosa untersucht. Bei diesen Erkrankun-gen verursachen neben einer genetischen Prädisposition vor allem exogene Faktoren eine überschießende Immunantwort, was nachfolgend weitere molekulare Signalwege beeinflusst und letztendlich zu einer manifesten Entzündung führen kann. Für die medikamentöse The-rapie stehen u. a. anti-entzündliche, immunsupprimierende Glucocorticoide (GC) wie Dexamethason zur Verfügung. GC weisen in der Langzeittherapie bekanntermaßen ein erhebliches Nebenwirkungspotential auf. Daher werden Alternativen, auch pflanzliche, er- forscht, die zwar die positiven, nicht aber die negativen Eigenschaften der GC besitzen sollen. Sekundäre Pflanzeninhaltstoffe, wie Endiandrin A aus der australischen Pflanze Endiandra anthropophagorum DOMIN, Ginsenosid Rg1 aus Panax ginseng C.A.MEY und Saikosaponin D aus Bupleurum falcatum L., zeigten die Fähigkeit auf, den GR binden zu können. Ziel dieser Arbeit war ihren Effekt genauer an einem GR-sensitiven Signalweg, im Speziellen der GR- abhängigen intestinalen Na+-Resorption, in der humanen Kolonkarzinom-zelllinie HT-29/B6-GR sowie am Rattenkolon zu charakterisieren. Es konnte demonstriert werden, dass ausschließlich die Inhaltsstoffe der E. anthropophagorum DOMIN befähigt waren, den GC-sensitiven epithelialen Na+-Kanal (ENaC)-vermittelten Na+-Transport zu beeinflussen. Obwohl keine alleinigen GR-transaktivierenden Eigenschaften ermittelt wur-den, unterstütze Endiandrin A, ein Cyclobutan- Lignan der australischen Pflanze, die Wirkung des GCs Dexamethason und dadurch auch einen beschriebenen Synergismus zwischen GC und TNF-α. Mit einer verstärkten Endiandrin A-induzierten Aktivierung der p38 MAP-Kinase (MAPK) ging eine Steigerung des Sgk-1-Expressionslevels und GR-Gesamtlevels (GR mRNA und Protein) einher. Endiandrin A bewirkte die Inhibierung der GC- und TNF-α-induzierten JNK-Aktivierung sowie eine erhöhte nukleäre GR- Translokation. Ebenso konnte Endiandrin A eine Zunahme der Expression von β- und γ-ENaC-Untereinheit bedingen und infolgedessen eine Erhöhung der GC- gesteuerten ENaC-vermittelten Na+-Resorption hervorrufen. Endiandrin A, bzw. die Pflanze E. anthropophagorum DOMIN, könnte demnach eine potentielle pflanzliche Alternative zu synthetischen GC in der Therapie chronisch- entzündlicher Erkrankungen darstellen, weil sie keine transaktivierenden Eigen-schaften aufweist, aber GR-abhängige Signalwege beeinflusst. Im zweiten Teil der Arbeit wurde der Fokus auf die Pflanze Bupleurum falcatum L. gelegt. Es handelt sich hierbei um eine bekannte Heilpflanze, die sehr häufig in der traditionellen asiati-schen Medizin verwendet wird. In der Phytotherapie stellt eine der häufigsten Darreichungsformen der Extrakt dar. Ziel war es, eine geeignete Methode zur Extraktherstel-lung und zum qualitativen Nachweis der wirksamkeitsbestimmenden Bupleurum-Inhaltsstoffe (Saikosaponine) zu ermitteln. Sowohl in der Auswahl des Extraktionsmittels, als auch in der Auswahl des Fließmittels für eine geplante Dünnschichtchromatographie (DC), müssen entsprechend der zu untersuchenden Stoffe gewisse Polaritäten beachtet werden. Die Sai-kosaponine besitzen zwar ein unpolares Steroidgrundgerüst, aber auch genügend Hydroxygruppen und damit polare Strukturen im Molekül. Somit sollte ein Lösungsmittel genau jene Eigenschaften aufweisen, um die Inhaltsstoffe optimal zu extrahieren. Es konnte demonstriert werden, dass einige beschriebene Methoden sich eher weniger, andere mehr für die Extraktherstellung eignen. Für den qualitativen Nachweis der Saikosaponine wurde das Fließmittel, das sich aus Ethylacetat, Ethanol und Wasser (8:2:1) zusammensetzt, als am besten geeignet ermittelt.","In recent years, the interest in phytotherapy steadily increased. Today research is focused on enlightening the phytopharmaceutical effects of medicinal plants, in order to establish the therapeutic use on basis of experimental data. In the first part of this work, plant-derived glucocorticoid receptor (GR) modulators were analyzed. Chronic inflammatory diseases are diseases of the western lifestyle, mainly caused by genetic and environmental factors leading to an uncontrolled immune response, which impact other signaling pathways and result in a manifest inflammation. For the medici-nal treatment, glucocorticoids (GC) as e.g. dexamethasone are applied, basically focused on suppressing the inflammation. However, GCs often show various and serious side effects, especially in the long-term treatment. Therefore, alternatives including plant-derived drugs are highly appreciated, which only have to possess the positive characteristics of GCs. A few secondary plant-compounds, e.g. endiandrin A from the Australian tree Endiandra anthropo-phagorum DOMIN, ginsenoside Rg1 from Panax ginseng C.A.MEY and saikosaponin D from Bupleurum falcatum L., showed the ability to bind to the GR. Our aim was to characterize their effects more in detail on a GR- sensitive signaling pathway, especially the GR-dependent intestinal Na+ absorption, in the human colon carcinoma cell line HT-29/B6-GR as well as in rat colon specimens in vivo. It was demonstrated that only compounds from E. anthropophagroum DOMIN were able to influence the GC-dependent epithelial Na+ chan-nel (ENaC)-mediated Na+ transport. The results showed that while endiandrin A, a cyclobutane lignan of the Australian plant, alone possessed no significant GR transactivation capacity, it could effectively facilitate the effect of the GC dexamethasone and thereby also support the synergism between GCs and TNF-α. Endiandrin A enhanced p38 MAP-kinase activation and this was accompanied by an increase in Sgk-1 expression as well as total GR levels (GR mRNA and protein levels). Furthermore, endiandrin A inhibited GC-and TNF-α-induced JNK activation and increased levels of GR localized to the nucleus. Additionally, it caused an up-regulation of the β- and γ-ENaC subunit expression which enhanced GC-sensitive ENaC-mediated Na+ absorption. Endiandrin A or rather the plant E. anthropophag-roum DOMIN may serve as potential herbal alternative to synthetic GCs for the treatment of chronic inflammatory diseases as they show no transcriptional activation, but affect GR-dependent signaling pathways. The second part of this work focused on Bupleurum falcatum L., a well-known medicinal plant extensively used in traditional Asian medicine. Extracts are one of the most common pharmaceutical application forms. The aim was to determine an efficient method for the extraction and for the qualitative analysis of Bupleurum’s active ingredients (saikosaponins). According to the substances to be analyzed, certain polarities must be observed for selecting an extracting solvent as well as a mobile phase of an intended thin-layer chromatography. Indeed, saikosaponins exhibit a non-polar steroidal structure, but they also have enough hydroxyl groups and thus polar characteristics. Therefore the solvent should have exactly those characteristics to extract the active substance in an optimal manner. It was demon-strated that some described methods are less well, others more suitable for the extract manufacturing. For qualitative analysis of saikosaponins the ideal eluent was composed of ethyl acetate, ethanol and water (8:2:1).","VII, 164 S.","https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/13517||http://dx.doi.org/10.17169/refubium-17715","urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000095400-1","ger","http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen","Epithelialer Natriumkanal (ENaC)||Sgk-1||MAPK||Glucocorticoidrezeptor||TNF-alpha","600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften::610 Medizin und Gesundheit::615 Pharmakologie, Therapeutik","Charakterisierung pflanzlicher Glucocorticoidrezeptor-Modulatoren und ihrer Wirkungen auf den epithelialen Natriumkanal (ENaC)","Characterization of plant-derived glucocorticoid receptor modulators and their effects on the epithelial sodium channel (ENaC)","Dissertation","free","open access","Text","Biologie, Chemie, Pharmazie","FUDISS_derivate_000000014289","FUDISS_thesis_000000095400"