id,collection,dc.contributor.author,dc.contributor.firstReferee,dc.contributor.furtherReferee,dc.contributor.gender,dc.date.accepted,dc.date.accessioned,dc.date.available,dc.date.embargoEnd,dc.date.issued,dc.description,dc.description.abstract[de],dc.description.abstract[en],dc.identifier.uri,dc.identifier.urn,dc.language,dc.rights.uri,dc.subject,dc.subject.ddc,dc.title,dc.title.translated[en],dc.type,dcterms.accessRights.dnb,dcterms.accessRights.openaire,dcterms.format[de],refubium.affiliation[de],refubium.mycore.derivateId,refubium.mycore.fudocsId,refubium.mycore.transfer "4d03edef-629e-4ed1-bc61-e2e2ab5fba6f","fub188/14","Blume, Astrid","Prof. Dr. Richard R. Schmidt","Prof. Dr. Regine Hengge-Aronis","n","2003-05-23","2018-06-08T00:30:48Z","2003-08-05T00:00:00.649Z","2003-08-06","2003","TITELBLATT, INHALT, TABELLEN, ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS, LEBENSLAUF, EIGENE PUBLIKATIONEN, DANKSAGUNG 3 1\. EINLEITUNG 11 1.1 Struktur und Vorkommen von Sialinsäuren 11 1.1.1 Struktur von Sialinsäuren 11 1.1.2 Vorkommen von Sialinsäuren 12 1.1.3 Sialylierte Oligosaccharidstrukturen auf Proteinen und Lipiden 13 1.2 Biologische Funktion von Sialinsäuren 15 1.2.1 Adhäsion und Zell-Zell-Interaktion 15 1.2.2 Sialinsäuren als Erkennungsdeterminanten für Pathogene 16 1.2.3 Sialinsäuren maskieren antigene Determinanten 17 1.2.4 Sialinsäuren beeinflussen die Struktur und Funktion von Glycokonjugaten 18 1.2.5 Sialinsäuren und Carcinome 18 1.3 Biosynthese von Sialinsäuren 19 1.3.1 Biosynthese von UDP-GlcNAc 20 1.3.2 Biosynthese von CMP-Neu5Ac 22 1.3.3 Biosynthese von sialylierten Oligosaccharidketten 24 1.4 Das Schlüsselenzym der Sialinsäurebiosynthese, die UDP-GlcNAc-2-Epimerase /ManNAc-Kinase 24 1.5 Zielsetzung der Arbeit 28 2\. EXPERIMENTELLER TEIL 31 2.1 Materialien 31 2.1.1 Vektoren 31 2.1.2 Bakterienstämme 31 2.1.3 Hefestämme 31 2.1.4 Insektenzellen 31 2.1.5 Medien und Kultivierung der Zellen 31 2.1.5.1 Bakterien 32 2.1.5.2 Hefen 32 2.1.5.3 Insektenzellen 34 2.1.5.4 CHO-Zellen 35 2.1.6 Primer 35 2.1.7 Chemikalien 35 2.1.8 Geräte 36 2.2 Methoden 36 2.2.1 Allgemeine molekularbiologische Methoden 36 2.2.1.1 Präparation von Plasmid-DNA 36 2.2.1.2 Reinigung von DNA 37 2.2.1.3 Fällung von DNA 37 2.2.1.4 Bestimmung von DNA-Konzentrationen 38 2.2.1.5 DNA-Spaltungen mit Restriktionsendonukleasen 38 2.2.1.6 Agarose-Gelelektrophorese 38 2.2.1.7 Isolierung von DNA-Fragmenten mittels Gelelution 39 2.2.1.8 Ligation von DNA-Fragmenten 39 2.2.1.9 Dephosphorylierung von DNA 40 2.2.1.10 Herstellung kompetenter Escherichia coli-Zellen 40 2.2.1.11 Transformation von Plasmid-DNA in Escherichia coli 40 2.2.1.12 Sequenzierungen 41 2.2.1.13 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) 41 2.2.1.14 Herstellung von Punktmutanten 42 2.2.2 Expression von rekombinantem Protein in Escherichia coli 42 2.2.2.1 Ermittlung der optimalen Expressionsbedingungen 42 2.2.2.2 Expression von rekombinantem Protein in Escherichia coli 43 2.2.3 Expression von rekombinantem Protein in Saccharomyces cerevisiae 44 2.2.3.1 Herstellung kompetenter Saccharomyces cerevisiae-Hefezellen 44 2.2.3.2 Transformation von Plasmid-DNA in Saccharomyces cerevisiae 44 2.2.3.3 Ermittlung der optimalen Expressionsbedingungen 45 2.2.3.4 Expression von rekombinantem Protein in Saccharomyces cerevisiae 45 2.2.4 Expression von rekombinantem Protein in Pichia pastoris 46 2.2.4.1 Herstellung kompetenter Pichia pastoris-Zellen 46 2.2.4.2 Linearisieren der Plasmid-DNA 46 2.2.4.3 Elektroporation von Pichia pastoris-Hefezellen 46 2.2.4.4 Ermittlung des Mut-Phänotyps 47 2.2.4.5 Ermittlung der optimalen Expressionsbedingungen 47 2.2.4.6 Lyse von Hefezellen 48 2.2.4.7 Expression von rekombinantem Protein in Pichia pastoris 48 2.2.5 Expression von rekombinantem Protein in Insektenzellen 49 2.2.5.1 Herstellung von rekombinanter Bacmid-DNA 49 2.2.5.2 Analyse der Bacmid-DNA 50 2.2.5.3 Herstellung von rekombinantem Virus 50 2.2.5.4 Analyse der Viren 51 2.2.5.5 Amplifikation von Virus 51 2.2.5.6 Bestimmung des Virus-Titers 52 2.2.5.7 Ermittlung der optimalen Expressionsbedingungen 52 2.2.5.8 Expression von rekombinantem Protein in Insektenzellen 53 2.2.6 Allgemeine proteinbiochemische Methoden 54 2.2.6.1 Proteinbestimmung nach Bradford 54 2.2.6.2 Konzentrieren von Proben 54 2.2.6.3 Diskontinuierliche SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese 54 2.2.6.4 Coomassie-Färbung von Proteingelen 56 2.2.6.5 Silberfärbung von Proteingelen 56 2.2.6.6 Western-Blot 56 2.2.6.7 Immunologischer Proteinnachweis auf Nitrocellulosemembranen 57 2.2.6.8 UDP-GlcNAc-2-Epimerase-Assays 57 2.2.6.9 ManNAc-Kinase-Assays 58 2.2.6.10 UDP-Gal-4-Epimerase-Assay 59 2.2.6.11 Beta-Gal-Assay 60 2.2.6.12 Testen verschiedener inhibitorischer Strukturen 60 2.2.6.13 Bestimmung der oligomeren Strukturen 60 2.2.7 Reinigung der UDP-GlcNAc-2-Epimerase/ManNAc-Kinase 61 2.2.7.1 Glutathion-Affinitätschromatographie 61 2.2.7.2 Ni-NTA-Affinitätschromatographie 62 2.2.7.3 Salminsulfatpräzipitation 62 2.2.7.4 MonoQ-Chromatographie 63 2.2.7.5 Hydroxyapatit-Chromatographie 63 2.2.7.6 ATP-Agarose-Chromatographie 64 2.2.7.7 Blue- und Red-Sepharose-Chromatographie 64 2.2.7.8 Phenylsepharose-Chromatographie 64 2.2.7.9 Gelfiltration 65 2.2.7.10 Analyse der erhaltenen Fraktionen 65 2.2.8 Chemische Synthese von UDP-GlcNAc-Derivaten 65 2.2.8.1 Synthese von oxidiertem UDP-GlcNAc 66 2.2.8.2 Synthese von oxidiertem Uridin 66 2.2.8.3 Synthese von oxidiertem Methylribosid 67 2.2.8.4 Synthese von reduziertem o-UDP-GlcNAc 67 2.2.9 NMR-Untersuchungen der UDP-GlcNAc-2-Epimerase/ManNAc-Kinase 68 2.2.9.1 Proteinreinigung für NMR-Untersuchungen 68 2.2.9.1 STD-NMR-Messungen 69 3\. ERGEBNISSE 71 3.1 Expression der UDP-GlcNAc-2-Epimerase/ManNAc-Kinase in Escherichia coli 71 3.1.1 Expression der UDP-GlcNAc-2-Epimerase/ManNAc-Kinase mit GST-Tag 71 3.1.2 Reinigung und Charakterisierung der GST-UDP-GlcNAc-2-Epimerase/ManNAc- Kinase 73 3.1.3 Expression der UDP-GlcNAc-2-Epimerase/ManNAc-Kinase mit His-Tag 74 3.1.4 Reinigung und Charakterisierung der His-UDP-GlcNAc-2-Epimerase/ManNAc- Kinase 75 3.1.5 Versuche zum Auflösen der UDP-GlcNAc-2-Epimerase/ManNAc-Kinase-Aggregate 76 3.2 Expression der UDP-GlcNAc-2-Epimerase/ManNAc-Kinase in Hefe 77 3.2.1 Expression der UDP-GlcNAc-2-Epimerase/ManNAc-Kinase in Saccharomyces cerevisiae 78 3.2.2 Methanol induzierte Expression der UDP-GlcNAc-2-Epimerase/ManNAc-Kinase in Pichia pastoris 79 3.2.3 Konstitutive Expression der UDP-GlcNAc-2-Epimerase/ManNAc-Kinase in Pichia pastoris 86 3.3 Expression der UDP-GlcNAc-2-Epimerase/ManNAc-Kinase in Insektenzellen 91 3.3.1 Expression der UDP-GlcNAc-2-Epimerase mit dem BAC-TO-BAC-Baculovirus- Expressionssystem 92 3.3.2 Reinigung der UDP-GlcNAc-2-Epimerase/ManNAc-Kinase 96 3.3.3 Reinigung der His-UDP-GlcNAc-2-Epimerase/ManNAc-Kinase 102 3.3.4 Auflösen der UDP-GlcNAc-2-Epimerase/ManNAc-Kinase-Aggregate 103 3.4 Generierung und Charakterisierung von Deletionsmutanten 106 3.4.1 Generierung der Deletionsmutanten 107 3.4.2 Enzymatische Aktivitäten der Deletionsmutanten 113 3.4.3 Oligomerer Zustand der Deletionsmutanten 115 3.4.4 Hemmung der Deletionsmutanten durch CMP-Neu5Ac 118 3.5 Synthese und biochemische Charakterisierung von UDP-GlcNAc-Derivaten als mögliche Enzyminhibitoren 119 3.5.1 Synthese von oxidierten UDP-GlcNAc Derivaten 120 3.5.2 Hemmung der UDP-GlcNAc-2-Epimerase/ManNAc-Kinase durch o-UDP-GlcNAc 121 3.5.3 Charakterisierung der Hemmung der Epimeraseaktivität der UDP- GlcNAc-2-Epimerase/ManNAc-Kinase durch o-UDP-GlcNAc Derivate 122 3.5.4 Charakterisierung der Hemmung der Kinaseaktivität der UDP- GlcNAc-2-Epimerase/ManNAc-Kinase durch o-UDP-GlcNAc und seine Derivate 124 3.5.5 Hemmung der UDP-Gal-4-Epimerase durch o-UDP-GlcNAc und o-UDP 126 3.5.6 Crosslinking der UDP-GlcNAc-2-Epimerase/ManNAc-Kinase durch o-UDP-GlcNAc 127 3.5.7 Wirkung von o-UDP auf CHO-Zellen 129 3.6 Biochemische Charakterisierung von weiteren potentiellen UDP- GlcNAc-2-Epimerase/ManNAc-Kinase-Inhibitoren 131 3.6.1 Derivate des UDP-GlcNAc als mögliche Inhibitoren der UDP- GlcNAc-2-Epimerase 131 3.6.2 Derivate des 2-Acetamidoglucals als mögliche Inhibitoren der UDP- GlcNAc-2-Epimerase 135 3.6.3 Analoga des Übergangszustandes als mögliche Inhibitoren der UDP- GlcNAc-2-Epimerase 136 3.6.4 Derivate der CMP-Neu5Ac als mögliche Inhibitoren der UDP- GlcNAc-2-Epimerase 137 3.6.5 UMP-Derivate als mögliche Inhibitoren der UDP-GlcNAc-2-Epimerase 139 3.6.6 Nikkomycin Z als möglicher Inhibitor der UDP-GlcNAc-2-Epimerase 140 3.6.7 Konzentrationsabhängige Hemmung der UDP-GlcNAc-2-Epimerase durch ausgewählte Inhibitoren 141 3.7 NMR-Untersuchungen zur Ligandenbindung der UDP-GlcNAc-2-Epimerase/ManNAc- Kinase 143 3.7.1 Grundlagen der NMR-Spektroskopie 143 3.7.2 Das STD-Experiment 144 3.7.3 NMR-Untersuchungen mit der UDP-GlcNAc-2-Epimerase 146 3.7.4 NMR-Untersuchungen mit der ManNAc-Kinase 149 4\. DISKUSSION 155 4.1 Expression und Reinigung der UDP-GlcNAc-2-Epimerase/ManNAc-Kinase 155 4.2 Deletionsmutanten der UDP-GlcNAc-2-Epimerase/ ManNAc-Kinase 158 4.3 Inhibition der UDP-GlcNAc-2-Epimerase/ManNAc-Kinase durch oxidierte UDP- GlcNAc-Derivate 162 4.4 Hemmung der UDP-GlcNAc-2-Epimerase/ManNAc-Kinase durch weitere Inhibitoren 164 4.5 NMR-Untersuchungen zur Ligandenbindung der UDP-GlcNAc-2-Epimerase/ManNAc- Kinase 166 5\. ZUSAMMENFASSUNG 169 5.1 Synopsis 171 6\. LITERATURVERZEICHNIS 173 7\. ANHANG 187","In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, daß es möglich ist, die UDP- GlcNAc-2-Epimerase/ManNAc-Kinase sowohl in prokaryontischen, als auch in eukaryontischen Zellen als aktives Protein zu exprimieren. Jedoch wurde sowohl bei der Expression in Bakterien als auch in Hefen und Insektenzellen jeweils ein großer Anteil des überexprimierten Proteins in hochmolekularen Aggregaten gefunden. Nur in Insektenzellen konnte lösliches aktives Enzym in Milligrammengen pro Liter exprimiert werden. Um die UDP-GlcNAc-2-Epimerase/ManNAc-Kinase biochemisch zu charakterisieren, wurde ein Reinigungsschema erarbeitet, nach dem das relativ instabile Enzym in möglichst kurzer Zeit zu reinigen ist. Dies gelang letztlich mit einem His- Tag-Fusionsprotein, das mittels Nickel-NTA-Agarose-Chromatographie und anschließender Gelfiltration bis zu Homogenität gereinigt werden konnte. Die beiden Aktivitäten des bifunktionellen Enzyms UDP-GlcNAc-2-Epimerase/ ManNAc-Kinase konnten getrennt voneinander exprimiert werden; jedoch führt dieses zu einem starken Aktivitätsverlust der jeweils noch vorhandenen Domäne. Die Domänen lassen sich demnach zwar noch getrennt exprimieren, beeinflussen sich in ihren Aktivitäten aber stark. Außerdem konnte durch verschiedene Deletionsmutanten des Enzyms gezeigt werden, daß sowohl N-terminale als auch C-terminale Deletionen zu einer Änderung des oligomeren Zustandes führen. Beim Wildtyp und bei kleinen Deletionen wurden hauptsächlich Hexamere nachgewiesen, bei größeren Deletionen überwiegen trimere Strukturen. Um die UDP-GlcNAc-2-Epimerase/ManNAc-Kinase weiter zu charakterisieren und die Suche nach Inhibitoren zu erleichtern, wurden die folgenden oxidierten UDP- GlcNAc-Derivate synthetisiert: o-UDP-GlcNAc, o-UDP, o-ADP, o-GDP, o-Uridin und o-Methylribosid. Diese Substanzen hemmen die Epimeraseaktivität in der aufgeführten Reihenfolge sehr effektiv und spezifisch. Jedoch handelt es sich um eine irreversible Hemmung, da es zur Ausbildung einer kovalenten Bindung zwischen Enzym und Inhibitor kommt. Weiterhin zeigen diese Ergebnisse, daß für eine gute Inhibierung der UDP-GlcNAc-2-Epimerase-Aktivität ein Uridin mit zwei negativ geladenen funktionellen Gruppen nötig ist, beispielsweise o-UDP oder o -UDP-GlcNAc. Bei der ManNAc-Kinase-Aktivität zeigt nur o-ADP eine nennenswerte Hemmung der Enzymaktivität. Dies belegt, daß das Enzym zwei getrennte aktive Zentren aufweist, die unabhängig voneinander arbeiten. Unter Berücksichtigung der Ergebnisse der Deletionsmutanten kann gefolgert werden, daß die beiden aktiven Zentren in unterschiedlichen Domänen lokalisiert sind. Verschiedene Derivate des Substrates bzw. des Übergangszustandes der Epimerasereaktion, des Intermediates 2-Acetamidoglucal, oder des natürlich vorkommenden Inhibitors CMP-Neu5Ac wurden auf ihre hemmende Wirkung untersucht. Gleichzeitig wurde mittels STD-NMR-Spektroskopie analysiert, wie natürliche Liganden mit der UDP-GlcNAc-2-Epimerase/ManNAc-Kinase interagieren, insbesondere wurden Bindungsepitope ermittelt. Die Ergebnisse der Inhibitionsversuche zusammen mit den NMR-Untersuchungen lassen Rückschlüsse zu, warum bestimmte Substanzen die Enzymaktivität recht gut inhibieren und andere weniger gut. Aus diesen Erkenntnissen ergibt sich danach folgendes vorläufiges Model für einen guten Inhibitor: ein Uridin- oder Cytidin- Nukleotid, das über eine Brücke mit zwei negativen Ladungen mit einem unpolaren Ring mit mindestens einem polaren Substituenten gekoppelt ist. Diese Informationen sind eine gute Basis für die Synthese weiterer Inhibitoren für die UDP-GlcNAc-2-Epimerase.","In this work it has been shown that it is possible to express active rat UDP- GlcNAc 2-epimerase/ManNAc kinase in both pro- and eukaryotic cells. In the case of bacterial and yeast based expression systems the significant majority of the expressed protein was produced as high molecular weight aggregates. Only in the case of insect cells has it proven possible to overexpress milligram quantities of soluble active protein per litre. To facilitate the biochemical characterisation of the enzyme, which is known to be relatively instable, the purification was optimised to be as rapid as possible. Purification to homogeneity was achieved in the end by the expression of the protein as a His-tag fusion followed by nickel-chelate chromatography and gel filtration. The two activities of the bifunctional enzyme UDP-GlcNAc 2-epimerase/ManNAc kinase can be separated albeit with a significant loss of activity. This suggests that the two domains influence one another whilst possessing separate functionality. In addition through the use of deletion mutants it has been possible to investigate the oligomeric state of the enzyme. Deletion at either the N or C terminus leads to a change in the oligomeric state, with a preference for a trimeric state with larger deletions and the native hexameric with smaller. To further characterise UDP-GlcNAc 2-epimerase/ManNAc kinase and in order to facilitate the design of inhibitors, the following inhibitors where synthesised and their activity investigated: o-UDP-GlcNAc, o-UDP, o-ADP, o-GDP, o-uridine and o-methylriboside. The inhibitors were found to have an effectivity and specificity in the order given. Therefore, to have a higher inhibition of the epimerase activity a uridine in conjunction with two negatively charged groups as in o-UDP and o-UDP-GlcNAc is required. In the case of the kinase activity only o-ADP demonstrated significant inhibitor activity suggesting that the two active sites are distinct and with the results of the deletion mutants localised in different domains. Inhibitors were synthesised based on the structures of the substrate, the epimerase intermediate, 2-acetamidoglucal and the naturally occurring inhibitor, CMP-Neu5Ac and examined with respect to their ability to inhibit the enzyme. With the use of STD-NMR the interaction of natural ligands with the enzyme was examined, with an emphasis on the binding epitope. The results of the inhibitor screening, together with those of the NMR investigation have allowed the drawing of conclusions as to why some compounds function well as inhibitors and other not. The preliminary model for good inhibition derived from this work is that of a uridine or cytidine nucleotide, attached via a spacer containing two negatively charge groups, to a non-polar ring possessing at least one polar substituent. This information is essential in the future design of drugs targeted towards the UDP-GlcNAc 2-epimerase.","https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/12056||http://dx.doi.org/10.17169/refubium-16254","urn:nbn:de:kobv:188-2003001951","ger","http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen","UDP-GlcNAc-2-Epimerase||ManNAc-Kinase||Sialic acid||Expression||Characterisation||STD-NMR","500 Naturwissenschaften und Mathematik::540 Chemie::540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften","Expression und funktionelle Charakterisierung des Schlüsselenzyms der Sialinsäurebiosynthese, UDP-GlcNAc-2-Epimerase/ManNAc-Kinase","Expression and Functional Characterisation of the key Enzyme of the Sialic Acid Biosynthesis, UDP-GlcNAc 2-Epimerase/ManNAc Kinase","Dissertation","free","open access","Text","Biologie, Chemie, Pharmazie","FUDISS_derivate_000000001029","FUDISS_thesis_000000001029","http://www.diss.fu-berlin.de/2003/195/"