id,collection,dc.contributor.author,dc.contributor.firstReferee,dc.contributor.furtherReferee,dc.contributor.gender,dc.date.accepted,dc.date.accessioned,dc.date.available,dc.date.issued,dc.description,dc.description.abstract[de],dc.description.abstract[en],dc.format.extent,dc.identifier.uri,dc.identifier.urn,dc.language,dc.rights.uri,dc.subject,dc.subject.ddc,dc.title,dc.title.translated[en],dc.type,dcterms.accessRights.dnb,dcterms.accessRights.openaire,dcterms.format[de],refubium.affiliation[de],refubium.mycore.derivateId,refubium.mycore.fudocsId "bbcd5f09-17cd-4cfb-9be3-13f4c72c9776","fub188/14","Güttler, Steffen","Prof. Dr. Richard A. Kroczek","Prof. Dr. Rupert Mutzel","m","2011-12-16","2018-06-07T23:56:57Z","2012-01-03T14:40:28.539Z","2012","Abbildungsverzeichnis VI Tabellenverzeichnis VII 1 Einleitung 1 1.1 Das adaptive Immunsystem 1 1.1.1 Antigenaufnahme und klassische Präsentation 1 1.1.2 Antigen-Kreuzpräsentation 3 1.2 Dendritische Zellen der Maus 4 1.2.1 Dendritische Zellen der lymphatischen Organe 4 1.2.2 Dendritische Zellen des murinen Darms 6 1.2.3 Antigen-Kreuzpräsentation von Subtypen muriner dendritischer Zellen 7 1.3 Dendritische Zellen des Menschen 9 1.3.1 Dendritische Zellen in humanem peripheren Blut 9 1.3.2 Funktionelle Eigenschaften humaner dendritischer Zellen 10 1.4 Chemokine und Chemokinrezeptoren 10 1.4.1 ATAC und XCR1 11 1.5 Methoden der Zelldepletion 12 1.5.1 Diphtherietoxin 13 1.6 Zelldepletion in genetisch veränderten Mausstämmen 14 1.7 Depletion dendritischer Zellen der Maus 15 1.8 Herstellung genetisch veränderter Mausmodelle 16 1.8.1 Herstellung von knock in-Mauslinien 16 1.8.2 Herstellung von (BAC-)transgenen Mäusen 17 1.9 Zielsetzung 18 2 Material und Methoden 19 2.1 Verwendete Chemikalien und Materialien 19 2.2 Verwendetes Probenmaterial 19 2.2.1 Tiere 19 2.2.2 Humanes Probenmaterial 19 2.3 Monoklonale Antikörper 20 2.4 Molekularbiologische Methoden 21 2.4.1 Isolierung von RNA 21 2.4.1.1 Isolierung von RNA aus Zellen 21 2.4.2 Isolierung von DNA 22 2.4.2.1 Isolierung von DNA aus Mausschwänzen und Stammzellen 22 2.4.2.2 Isolierung von DNA aus Bakterien 22 2.4.3 Amplifikation von DNA-Fragmenten durch Polymerasekettenreaktion 22 2.4.4 Klonierung von DNA Fragmenten 24 2.4.5 Southern Blot -Analyse 24 2.4.6 Transformation in Escherichia coli und Bakterienkultur 25 2.4.7 Gelelektrophoretische Auftrennung und Isolierung von DNA-Fragmenten 25 2.4.8 Quantitative real-time- PCR 26 2.5 Histologie 27 2.5.1 Detektion von β-Galaktosidaseaktivität in B6.XCR1:LacZ-Mäusen 27 2.6 Zellbiologische Methoden 28 2.6.1 Verwendete Zelllinien und Reagenzien 28 2.6.2 Zellkulturbedingungen 29 2.6.3 Bestimmung der Zellzahl in Suspensionen 29 2.6.4 Trypsinierung adhärenter Zellen 29 2.6.5 Einfrieren und Auftauen von Zellen 29 2.6.6 Isolierung und Kultivierung von embryonalen Fibroblasten der Maus 30 2.6.7 Elektroporation von embryonalen Stammzellen 30 2.6.8 Picken von ESC-Kolonien nach Elektroporation und Selektion 31 2.6.9 Kultivierung humaner CD8+ T-Zell-Klone 32 2.6.10 Herstellung von zellassoziiertem Antigen für humane Kreuzpräsentationsassays 32 2.7 Präparation primärer Zellen 33 2.7.1 Präparation primärer Zellen der Maus 33 2.7.1.1 Isolierung dendritischer Zellen aus lymphatischen Organen 33 2.7.1.2 Isolierung mononukleärer Zellen aus Dünndarmgewebe 33 2.7.1.3 Anreicherung von murinen DCs durch Dichtegradientenzentrifugation 34 2.7.2 Präparation primärer Zellen aus humanem peripheren Blut 34 2.7.2.1 Präparation mononukleärer Zellen aus humanem peripheren Blut (PBMCs) 34 2.7.2.2 Voranreicherung humaner DC-Populationen aus peripherem Blut 34 2.8 Herstellung humaner monozytengenerierte dendritischer Zellen 35 2.9 Durchflusszytometrie 35 2.9.1 Verwendete Farbstoffe 35 2.9.2 Oberflächenfärbung von Antigenen 36 2.9.3 Durchflusszytometrische Messung und Sortierung von Zellsuspensionen 37 2.9.3.1 Durchflusszytometrische Isolierung humaner Zellen 38 2.10 Kreuzpräsentationsassay 39 2.11 ELISA zur IFN-γ-Bestimmung 39 3 Ergebnisse 40 3.1 Charakterisierung der Expression von XCR1 in der Maus 40 3.1.1 Histologischer Nachweis von XCR1 in Geweben der Maus 40 3.1.2 Durchflusszytometrische Charakterisierung XCR1-tragender Zellen in lymphatischen Geweben 42 3.1.2.1 Durchflusszytometrische Analyse der XCR1-Expression in der Milz 42 3.1.2.2 Durchflusszytometrische Analyse der XCR1-Expression in mesenterialen Lymphknoten 45 3.1.2.3 Durchflusszytometrische Analyse der XCR1-Expression in Peyerschen Plaques 48 3.1.3 Analyse der antigenpräsentierenden Zellen des Dünndarms 49 3.1.3.1 Durchflusszytometrische Analyse der XCR1-Expression im Dünndarm 50 3.1.3.2 Analyse der XCR1-Expression im Dünndarm durch quantitative PCR 52 3.1.4 Einfluss eines inflammatorischen Stimulus auf XCR1-positive dendritische Zellen des mesenterialen Lymphknotens und des Darms 53 3.2 Herstellung einer XCR1-Diphtherietoxin A-Mauslinie 56 3.2.1 Herstellung des targeting-Vektors Version 1 58 3.2.2 Generierung und Analyse von XCR1:DTA-Stammzellklonen 59 3.2.3 Produktion und Verifizierung XCR1:DTA-chimärer Mäuse 61 3.2.4 Herstellung des targeting-Vektors Version 2, Generierung von Stammzellklonen und chimären Mäusen 63 3.3 Herstellung von XCR1-BAC-transgenen Mäusen 66 3.3.1 Herstellung einer BAC-transgenen XCR1:Cre-Rekombinase Maus 67 3.4 Analyse XCR1-positiver dendritischer Zellen aus humanem peripheren Blut 70 3.4.1 Identifikation und Isolierung von Subtypen dendritischer Zellen aus humanem peripheren Blut 70 3.4.2 Expression des Chemokinrezeptors XCR1 in humanem peripheren Blut 72 3.4.3 Nachweis der XCR1-Expression auf Proteinebene 74 3.4.4 Analyse der Antigen-Kreuzpräsentation der Subtypen dendritischer Zellen aus humanem Blut 75 4 Diskussion 79 4.1 XCR1 wird spezifisch auf kreuzpräsentierenden dendritischen Zellen exprimiert und ist besser zur Einteilung von Subtypen geeignet als klassische Marker 79 4.2 XCR1 definiert einen Subytp dendritischer Zellen der lymphatischen und peripheren Organe des intestinalen Trakts 81 4.3 Migrationseigenschaften von XCR1-positiven dendritischen Zellen nach einem inflammatorischen Impuls 83 4.4 Ein Mausmodell zur spezifischen Depletion kreuzpräsentierender dendritischer Zellen 85 4.5 Der Versuch der Herstellung einer XCR1-spezifischen Diphtherietoxin knock in- Maus 86 4.6 BAC-transgene Mauslinien als Alternative zur knock in-Strategie 88 4.7 Anwendungsmöglichkeiten XCR1+ DC-defizienter Mäuse 89 4.8 Selektive Expression des Chemokinrezeptors XCR1 auf humanen CD141-positiven dendritischen Zellen 90 4.9 CD141-positive dendritische Zellen sind die kreuzpräsentierenden Zellen des humanen Blutes 91 5 Zusammenfassung / Summary 93 5.1 Zusammenfassung 93 5.2 Summary 94 6 Literaturverzeichnis 95 7 Abkürzungsverzeichenis 116 8 Danksagung 119 9 Anhang 120 Vektorkarten 120 Lebenslauf 121 Publikationen 122 Konferenzbeiträge / Vorträge 123 Bescheinigung 124","Ausgangspunkt dieser Arbeit war die Beobachtung einer selektiven Expression des Chemokinrezeptors XCR1 auf CD8+ dendritischen Zellen (DCs) der murinen Milz. CD8+ DCs sind auf die Kreuzpräsentation von extrazellulärem Antigen spezialisiert, was für die Induktion einer zytotoxischen T-Zell-Antwort, insbesondere gegen virale Infektionen und Tumorzellen, von essenzieller Bedeutung ist. Während bekannt war, dass der XCR1-Ligand ATAC Chemotaxis dieses DC-Subtyps induziert, waren die Verteilung und Funktion der XCR1+ DCs außerhalb der Milz ungeklärt. Daher wurde zuerst die Lokalisation XCR1+ DCs mittels einer LacZ-Reportermaus untersucht, wobei ein Fokus auf den intestinalen Trakt gelegt wurde. Es konnte festgestellt werden, dass XCR1+ DCs in den untersuchten lymphatischen Organen mit T-Zellen kolokalisieren und auch im Gewebe des Dünndarms ubiquitär auftreten. Phänotypisch sind XCR1+ DCs durch Koexpression von Oberflächenproteinen gekennzeichnet, welche in der Literatur als Marker kreuzpräsentierender DCs beschrieben sind (CD8, CD103, CD205 und CD207). Für die Organe des Darms konnte weiterhin gezeigt werden, dass nach einem inflammatorischen Stimulus vor allem XCR1+ DCs einen migratorischen Charakter annehmen. Diesen Erkenntnissen zufolge definiert XCR1 einen DC- Subtyp, welcher in lymphatischen Organen und in der Peripherie eine phänotypische und funktionelle Einheit bildet. Es ist davon auszugehen, dass die Gesamtheit der XCR1+ DCs, vergleichbar den CD8+XCR1+ DCs der Milz, insbesondere zur Antigenkreuzpräsentation und zur Aktivierung zytotoxischer T-Zellen befähigt ist. XCR1-negative DCs zeichneten sich durch Expression des Chemokinrezeptors CX3CR1 sowie des Integrins CD11b aus. XCR1 und CX3CR1 definieren somit funktionell distinkte, sich nicht überlappende DC-Population. Um die Funktion der XCR1+ DCs in vivo zu untersuchen, sollte ein Mausmodell generiert werden, in welchem dieser DC-Subtyp spezifisch depletiert ist. Dieses Modell sollte die Rolle von XCR1+ DCs im Ruhezustand sowie in Infektionsstudien aufzeigen. Durch die Technik des knock in konnte keine gewünschte Mauslinie erhalten werden, sodass alternativ mit der Herstellung einer BAC-transgenen Mauslinie mit vergleichbarer Funktion begonnen wurde. Im menschlichen Immunsystem gelang es, XCR1+ DCs im peripheren Blut zu identifizieren, wobei die XCR1-Expression ausschließlich auf CD141+ DCs beschränkt war. Kokulturexperimente mit einem zytotoxischen T-Zell-Klon ergaben, dass CD141+XCR1+ DCs die anderen humanen DC-Subtypen in ihrer Kapazität zur Kreuzpräsentation von löslichem und zellassoziiertem Antigen deutlich übertreffen. Somit konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass CD141+XCR1+ DCs des Menschen das funktionelle Homolog zu kreuzpräsentierenden CD8+XCR1+ DCs der Maus darstellen.","The background for this study was the observation of selective expression of the chemokine receptor XCR1 on CD8+ Dendritic cells (DCs) of the murine spleen. CD8+ DCs are specialized in cross-presentation of extracellular antigen which is essential for the induction of cytotoxic T-cell-responses against viral infections and tumor cells. While it was known previously that the XCR1-ligand ATAC induces chemotaxis of this DC-subtype, the distribution and function of XCR1+ DCs outside of the spleen remained elusive. We analyzed the localization of XCR1+ DCs using a LacZ-reporter mouse and focusing mainly on the intestinal system. We found that XCR1+ DCs in the tested lymphatic organs co-localize with T-cells and occur in the small intestine abundantly. Phenotypically, XCR1+ DCs co-express surface proteins referred to in the literature as markers of cross-presenting DCs (CD8, CD103, CD205 and CD207). Upon an inflammatory stimulus the XCR1+ subset gains a migratory character in the intestinal organs. These results show that XCR1 defines a DC-subtype in lymphatic organs and the periphery that represents a phenotypic and functional unity. It can be assumed that the entirety of XCR1+ DCs, like the XCR1+CD8+ of the spleen, is superior in crosspresentation of antigen and in the activation of cytotoxic T-cells. XCR1-negative DCs are characterized by the expression of the chemokine receptor CX3CR1 and the integrin CD11b. XCR1 and CX3CR1 define functional distinct and non-overlapping DC-populations. To further characterize the function of XCR1+ DCs in vivo, we propose the production of a mouse-line with specific depletion of this DC-subset. This model will enable the demonstration of the role of XCR1+ DCs in the steady state and in infectious studies. However, using the knock-in technique, no suitable mouse- line could be obtained. As an alternative approach, we started the generation of BAC-transgenic mice allowing comparable analyses. In humans XCR1+ DCs were identified in the peripheral blood, whereas XCR1-expression was limited to the subset of CD141+ DCs. Co-culture-experiments with a cytotoxic T-cell-clone revealed that CD141+XCR1+ DCs excel in their capacity for cross-presentation of soluble and cell-associated antigen compared to the other DC-subsets. Summarizing these results show that human CD141+XCR1+ DCs are the functional homologue of cross-presenting CD8+XCR1+ DCs in the mouse.","VII, 124 S.","https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/11231||http://dx.doi.org/10.17169/refubium-15429","urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000035529-8","ger","http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen","antigen||cross-presentation||Dendritic cell||XCR1","500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie","Funktionelle Charakterisierung XCR1-positiver dendritischer Zellen in der Maus und beim Menschen","Functional characterization of XCR1-positive dendritic cells in mouse and man","Dissertation","free","open access","Text","Biologie, Chemie, Pharmazie","FUDISS_derivate_000000012360","FUDISS_thesis_000000035529"