Synaptogenesis is a collaborative effort of activity-independent processes specifying neuronal connections, and activity-dependent processes refining these initial synaptic connections. CALEB, an activity-dependent modulated protein, might be implicated in this refinement. The aim of my work was to investigate the mechanism of CALEB (Chicken Acidic Leucine rich EGF-like domain containing brain protein) down regulation, which was identified in an initial screen. I showed that cell surface CALEB down regulation was enhanced in retinal cultures incubated with KCl or agonist of glutamate receptors. Modulation of extracellular calcium concentration and experiments using blockers of calmodulin revealed the involvement of calcium in the mechanism of down regulation. Since CALEB belongs to the EGF family of growth and differentiation factors that undergo cell surface cleavage, I hypothesized a similar phenomenon responsible for the cell surface down regulation of CALEB. Isolation of a soluble component in supernatants of KCl treated cultures and a remaining membrane-tethered part in KCl incubated retinal cultures confirmed my hypothesis. I showed in membrane fraction incubation experiments that cleavage of CALEB ectodomain was caused by the catalytic action of a membrane protease, which could be prevented in the presence of metalloprotease inhibitor. For a detailed analysis of CALEB shedding, I showed that blockade of two ADAMs (A disintegrin and metalloprotease) with inhibitors as well as increased expression of one ADAM resulted in a decrease of total CALEB in comparison to cell lines co-expressing dominant negative form of the same ADAM and CALEB. Further experiments showed the involvement of Erk kinase in ectodomain shedding of CALEB. In another part of the project, I investigated the expression and localization of CALEB in the visual system in order to predict a plausible role of CALEB during development. Deglycosylation experiments showed CALEB as a highly glycosylated brain specific protein. Subcellularly, CALEB was enriched in the synaptic junction fractions pointing to a possible role of CALEB in synapses. The developmentally regulated expression of CALEB was observed in the visual system. My findings suggest that neuronal activity induced by depolarization facilitates ectodomain shedding of CALEB by the action of metalloproteases. The expression profile and localization confirms CALEB to be a brain specific, glycosylated transmembrane protein, which might have a role during the formation or maintenance of synapses.
Die Bildung von Synapsen wird durch das Zusammenspiel von aktivitäts- unabhängigen Prozessen, die neuronale Verbindungen spezifizieren, und von aktivitäts-abhängig Prozessen, welche die Feinabstimmung synaptischer Verbindungen beeinflussen, bestimmt. Bei Letzterem könnte CALEB, ein aktivitat-abhängig moduliertes Protein, von Bedeutung sein. Das Ziel meiner Arbeit war es, den Mechanismus der aktivitäts-abhängigen Modulation von CALEB (Chicken Acidic Leucine-rich EGF-like domain containing brain protein) zu untersuchen. Ich konnte zeigen, dass in Retinakulturen nach Inkubation mit KCl oder Glutamatrezeptoragonisten eine Herunterregulierung von CALEB an der Zelloberfläche innerhalb von fünf Minuten verstärkt wird. Durch Änderung der extrazellulären Kalziumkonzentration und durch die Verwendung von Calmodulininhibitoren konnte die Beteiligung von Kalzium an diesem Prozess demonstriert werden. Da CALEB ein Mitglied der EGF-Familie von Wachstums- und Differenzierungsfaktoren ist, postulierte ich, dass es bei der Herunterregulierung von CALEB zu einer Ektodomänenabspaltung kommt. Das Auffinden einer löslichen Komponente im Überstand von KCl-behandelten Kulturen, sowie eines membranständigen Restfragments in Retinakulturen bestätigten meine Hypothese. Mittels Inkubation von Membranfraktionen konnte ich zeigen, dass die Abspaltung der CALEB-Ectodomäne durch Metalloproteaseinhibitoren verhindert wird. Zur genaueren Charakterisierung der Abspaltung der CALEB-Ectodomäne wurden die beiden ADAM Proteasen (A disintegrin and metalloprotease), ADAM 10 und ADAM 17 untersucht. Die Blockierung von ADAM 10 und ADAM 17 mit pharmakologischen Inhibitoren verhinderte die Spaltung von CALEB. Darüberhinaus führte eine erhöhte Expression von ADAM 10 zu einer Abnahme des CALEB Gesamtproteins im Vergleich zu dominant negatives ADAM 10. Weitere pharmakologischen Experimente ließen auf eine Beteiligung der Erk-Kinase bei der Abspaltung der CALEB-Ectodomäne schliessen. Eine weitere Aufgabe dieser Arbeit war es, die Expression und Lokalisation von CALEB im visuellen System zu untersuchen. Deglykosylierungsexperimente zeigten, dass es sich bei CALEB um ein in hohem Maße glykosyliertes, Gehirn-spezifisches Protein handelt. Subzellulär wird CALEB mittels "post-synaptic density preparation" in der "synaptischen junction Fraktion" angereichert, was auf eine mögliche Rolle von CALEB in Synapsen hindeutet. Eine entwicklungs-abhängig regulierte Expression von CALEB wurde im visuellen System beobachtet. Meine Untersuchungen lassen vermuten, dass neuronale Aktivität die Abspaltung der äußeren Domäne durch Metalloproteasen fördert. Das Expressionsprofil und die Lokalisation von CALEB bestätigen, dass es sich bei CALEB um ein gehirnspezifisches, glycosyliertes Transmembranprotein handelt, welchem eine Rolle während der Bildung und Erhaltung von Synapsen zukommen könnte.
