dc.contributor.author
Escobar Fernández, Helena
dc.date.accessioned
2018-06-08T01:36:31Z
dc.date.available
2016-03-03T08:54:00.519Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/13597
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-17795
dc.description.abstract
Miyoshi myopathy (MM), limb girdle muscular dystrophy 2B (LGMD2B) and distal
anterior compartment myopathy (DACM) are rare autosomal recessive muscle
disorders caused by mutations in dysferlin. They are encompassed by the term
dysferlinopathy and affect the proximal and/or distal muscles of the limbs.
Patients usually become wheelchair bound within 15 years of disease onset due
to progressive muscle degeneration, weakness and atrophy. No treatment is
available. The dysferlin gene spans over 150 kb of genomic DNA in chromosome
2p13 and comprises 55 exons that form a coding sequence of 6.2 kb. Dysferlin
is a 237 kDa protein of the ferlin family. It is expressed in many tissues,
but more strongly in muscle, where it is found in mature myofibers and to some
extent also in satellite cells and myoblasts. It has important roles in
membrane repair and in maintaining the transverse tubule structure in
myofibers. Besides alterations of these two functions, defects in dysferlin
cause increased inflammatory attack to muscle fibers thereby enhancing the
muscle pathology. Muscle regeneration relies on muscle stem cells, called
satellite cells, and their progeny of muscle precursors, the myoblasts. Upon
muscle injury caused by severe trauma or muscle disorders, they are capable of
extensive proliferation to repair the damaged tissue. Satellite cells are
marked by the expression of the transcription factor Pax7, they can be
isolated based on specific surface markers and have a robust engraftment
potential when transplanted into regenerating muscles. Therefore, autologous
or allogeneic satellite cell and myoblast transplantation are envisioned as
promising therapeutic alternatives. Given that a single gene is causative for
dysferlinopathy, gene therapy also holds great promise. However, the large
size of the full-length dysferlin coding sequence represents a challenge for
gene transfer approaches because most viral vectors used in gene therapy have
a lower cargo capacity. Sleeping Beauty transposon is a non-viral bi-component
vector system consisting of a transposon DNA sequence and a transposase
protein. The transposase excises the transposon from a donor plasmid and
integrates it into the target genome. Since the transposon can be engineered
to carry any sequence of interest, Sleeping Beauty is very valuable as a
genetic tool for stable gene transfer and has been widely used in gene
therapy. Sleeping Beauty system can be used to integrate transgenes up to ~8
kb with high efficiency. It is therefore well-suited for delivery of full-
length dysferlin. In this work, I developed a non-viral cell-based gene
therapy approach for dysferlinopathy. Using Sleeping Beauty transposon, I
transferred the full-length human dysferlin cDNA into dysferlin deficient H2K
A/J mouse myoblasts, leading to restoration of dysferlin protein expression in
vitro. I transplanted the corrected myoblasts into dysferlin deficient
Scid/blAJ mice following local irradiation of the recipient muscles. This step
was necessary to ablate the endogenous satellite cells and promote engraftment
of the transplanted cells. I found up to ~90 dysferlin expressing myofibers 3
and 6 weeks post-transplantation. Inducing regeneration in the recipient
muscles simultaneously to cell transplantation by injection of cardiotoxin, a
snake venom toxin that causes acute damage to myofibers, further enhanced
engraftment of the donor cells. In muscles treated with cardiotoxin in
addition to irradiation, I found up to ~1000 donor-derived myofibers 3 and 6
weeks after grafting, which were present almost along the entire length of the
muscles. Moreover, I found numerous Pax7+ cells in the vicinity of donor-
derived myofibers in the grafted muscles. Given that recipient muscles were
irradiated prior to grafting, this suggests that donor myoblasts were able to
repopulate the host satellite cell compartment upon transplantation.
Engraftment as satellite cells would ensure long-term contribution of donor-
derived cells to muscle regeneration. These results show the feasibility of
long-term full-length dysferlin reconstitution in skeletal muscle through ex
vivo gene transfer with Sleeping Beauty.
de
dc.description.abstract
Miyoshi Myopathie (MM), Gliedergürteldystrophie Typ 2B (engl. limb girdle
muscular dystrophy 2B, LGMD2B) und die DACM (distal anterior compartment
myopathy) sind seltene, autosomal rezessiv vererbte Krankheiten, die durch
Mutationen im Dysferlin-Gen verursacht werden. Diese muskulären Erkrankungen
werden unter dem Begriff Dysferlinopathie zusammengefasst und betreffen die
proximale und/oder die distale Muskulatur der Extremitäten. Durch eine
zunehmende Schwächung und Atrophie der Muskeln sind Patienten normalerweise
bereits 15 Jahre nach Krankheitsbeginn an den Rollstuhl gebunden.
Behandlungsmöglichkeiten gibt es hier keine. Das Dysferlin-Gen umfasst einen
150 kb-Bereich der genomischen DNA auf Chromosom 2p13 und beinhaltet 55 Exons
mit einer kodierenden Sequenz von 6,2 kb. Dysferlin ist ein 237 kDa Protein
der Ferlinfamilie. Es ist in vielen Geweben vorhanden, vor allem im
Muskelgewebe, wo es in ausgereiften Muskelfasern, aber auch in
Satellitenzellen und Myoblasten exprimiert wird. Dysferlin spielt eine
wichtige Rolle bei der Membranreparatur und der Aufrechterhaltung der T-Tubuli
Struktur in den Muskelfasern. Auβer dem erhöht sich durch ein defektes
Dysferlinprotein die Entzündungsanfälligkeit der Muskelfasern. Die
Regenerationsfähigkeit von Muskeln beruht auf den Muskelstammzellen
(Satellitenzellen) und ihren Abkömmlingen, den Muskelvorläuferzellen
(Myoblasten). Bei Muskelverletzungen, z.B. durch schwere Verwundungen oder
durch Muskelerkrankungen, vermehren sich diese Zellen extensiv um das
geschädigte Gewebe zu reparieren. Satellitenzellen sind durch die Expression
des Transkriptionsfaktors Pax7 gekennzeichnet. Ihre Isolation basiert auf
spezifischen Oberflächenmarkern. Zudem haben sie ein hohes Anwachspotential,
wenn sie in sich regenerierendes Muskelgewebe tranplantiert werden. Deshalb
gilt die autologe oder allogene Transplantation von Satellitenzellen oder
Myoblasten als vielversprechende therapeutische Alternative. Da
Dysferlinopathien durch ein einzelnes Gen verursacht werden, ist zudem die
Gentherapie hier sehr erfolgversprechend. Allerdings werden
Gentransferversuche durch die Gröβe der kodierenden Dysferlinsequenz
erschwert, da die meisten viralen Vektoren, welche für Gentherapiezwecke
benutzt werden, eine zu geringe Ladungskapazität besitzen. Das Sleeping Beauty
Transposon ist ein nicht-virales 2-Komponenten Vektorsystem, welches aus der
DNA Sequenz des Transposons und einem Transposase Protein besteht. Die
Transposase schneidet das Transposon aus dem Donorplasmid heraus und
integriert es in das Zielgenom. Da das Transposon so verändert werden kann,
dass es jede Zielsequenz beinhalten kann, ist Sleeping Beauty ein sehr
wichtiges, nicht-virales, genetisches Werkzeug, das einen stabilen Gentransfer
ermöglicht und deshalb häufig in der Gentherapie verwendet wird. Durch das
Sleeping Beauty System kann ein bis zu 8 kb groβes Transgen effizient
integriert werden. Damit ist es auch für die Integration des vollständigen
Dysferlin-Gens sehr gut geeignet. Im Rahmen dieser Arbeit habe ich eine
Methode entwickelt, welche einen nicht-viralen zellbasierten Ansatz zur
Gentherapie von Dysferlinopathien ermöglicht. Durch Nutzung des Sleeping
Beauty Transposons ist es mir gelungen, die vollständige humane Dysferlin
cDNA-Sequenz in Dysferlin-defiziente H2K A/J Myoblasten der Maus zu
transferieren und die Dysferlinexpression in vitro wieder herzustellen. Die so
korrigierten Myoblasten habe ich in Dysferlin-defiziente Scid/blAJ Mäuse
transplantiert, in denen der Empfängermuskel zuvor lokal bestrahlt wurde.
Dieser Schritt war notwendig, um die Anzahl der endogenen Satellitenzellen zu
verringern und das Anwachsen der transplantierten Zellen zu fördern. 3-6
Wochen nach der Transplantation konnte ich eine Dysferlinexpression in bis zu
90 Muskelfasern nachweisen. Eine gleichzeitig zur Transplantation
stattfindende Injektion des Zellgiftes Cardiotoxin führte zu einem wesentlich
verbesserten Anwachsen der Donorzellen. Muskeln, welche zusätzlich zur
Bestrahlung noch mit Cardiotoxin geschädigt wurden, wiesen 3 bis 6 Wochen nach
der Transplantation bis zu 1000 Dysferlin exprimierende Muskelfasern auf.
Zudem konnte ich in den transplantierten Muskeln eine Vielzahl von Pax7
positiven Zellen in der Umgebung der von den Spenderzellen abgeleiteten
Myofibrillen identifizieren. Da der Empfängermuskel vor der Transplantation
bestrahlt wurde, deutet dieses darauf hin, dass das Satellitenzellkompartiment
des Empfängermuskels nach der Transplantation wieder neu besiedelt wurde. Das
Anwachsen der Myoblasten als Satellitenzellen würde daher einen dauerhaften
Beitrag der Spenderzellen zur Regeneration des Muskels belegen. Diese
Ergebnisse zeigen, dass eine Rekonstruktion des vollständigen Dysferlin
Proteins in Skelettmuskeln durch Sleeping Beauty vermittelten Gentransfer
möglich ist.
de
dc.format.extent
xviii, 108 Seiten
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
Sleeping Beauty transposon
dc.subject
myoblast transplantation
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::572 Biochemie
dc.title
A cell-based gene therapy approach for dysferlinopathy using Sleeping Beauty
transposon
dc.contributor.contact
helena.escobar@mdc-berlin.de
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. med. Simone Spuler
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Sigmar Stricker
dc.date.accepted
2015-11-18
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000100781-2
dc.title.translated
Entwicklung eines nicht-viralen zellbasierten Ansatz zur Gentherapie von
Dysferlinopathien durch Nutzung des Sleeping Beauty Transposons
de
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000100781
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000018797
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access